Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

翻訳速度 / コドン / mRNA / tRNA / リボソーム

tRNA / 翻訳 / タンパク質合成 / 遺伝暗号解読 / コドン / リボソーム

前年度では翻訳中ペプチジルtRNAの抽出法を確立させたが、レポーター遺伝子のテストコドンを解読したペプチジルtRNAのみを精製する方法を確立することができなかった。そのため、今年度は一部方針を変更し、各アミノ酸のコドンを1種類に限定したレポーター遺伝子を大腸菌細胞内または無細胞翻訳系で発現させ、抽出したペプチジルtRNAのtRNA部分を配列解析することによってアイソデコーダーの使用頻度を算出する方法の確立に取り組んだ。レポーター遺伝子は３種類設計した。また、前年度に課題となったペプチジルtRNA以外のtRNAの非特異的な混入を解決する方法として、選択的デアシル化とデアシルtRNAの3’末端処理を組み合わせることによってペプチジルtRNAのみをアダプターにライゲーションする方法を試行錯誤し、最終的にその確立に成功した。これらの方法を用いて、上記のレポーター遺伝子を大腸菌細胞または無細胞翻訳系によってそれぞれ発現させ、ペプチジルtRNAを抽出し、ＮＧＳ解析によって各tRNAの定量解析を行った。この時、tRNAプール中の各tRNAの存在量比を測定するため、未処理の全tRNA画分についても定量解析を行っている。その結果、無細胞翻訳系では、特定のアイソデコーダーtRNAにしか読まれないコドンを有したレポーター遺伝子ではそれぞれ対応するtRNAの相対量が顕著に高く検出されたことから、実験系が機能していることが証明できた。また、複数種のアイソデコーダーtRNAによって読まれるコドンについては、アイソデコーダーtRNAの使用頻度はtRNAプール中の存在比とは異なり、コドン種によって特徴があることが分かってきた。一方、大腸菌細胞のデータではそのような差が見られなかった。これはレポーター遺伝子の発現量が内在遺伝子の発現量を凌駕できずそれら由来のペプチジルtRNAによるものと考えられた。

ゼブラフィッシュ / コドン / tRNA / mRNA分解 / リボソーム

本研究では、分化が進行するゼブラフィッシュ初期胚において、コドンがmRNA安定性に与える影響（コドン効果）を定量的に解析するPACE法を開発した。この方法を用い、コドン効果がコドンに対応するtRNAの量とリボソームによる翻訳速度と相関することを明らかにした。またtRNAの量の変化がコドン効果の変化につながることを実験的に証明した。さらに、コドン効果によるmRNA分解機構が、リボソームによる翻訳の品質管理機構No-go decayとは独立の経路で働くことを明らかにした。

本研究により、タンパク質読み枠のコドンの組み合わせが細胞内においてmRNAの安定性に影響を及ぼす際の原理の一端が明らかとなった。また、コドンがmRNAの安定性に与える効果が、tRNAの量的な変化によって変動することが示された。この成果により、細胞内においてmRNAの安定性がどのように決まっているのかという本質的な疑問の解明が進んだ。この成果は、生命の基礎原理の理解のみならず、将来的にはmRNAワクチンに代表されるmRNA医薬品の開発にも大きく貢献することが期待される。

遺伝暗号 / ミトコンドリア / tRNA / アンチコドン / 動物の進化 / ｔＲＮＡ / 修飾塩基 / 初期遺伝暗号 / ｔRNA / 分子進化 / 動物ミトコンドリア / 非普遍暗号 / コドン / ウォブル位

動物ミトコンドリアでは通常の普遍暗号とは異なる変則暗号を用いていることが知られている。棘皮動物であるウニのミトコンドリアでは、通常LysをコードするAAAコドンがAsnに、通常ストップコドンであるUGAがTrpに、通常ArgのコドンであるAGR(R=A, G)がSerにそれぞれ変化している。これらの変則暗号の成立基盤を解明するために、ミトコンドリアtRNAを単離精製し、質量分析法を用いてアンチコドンの修飾を調べた。キタムラサキウニの卵巣より抽出したtotal RNAを陰イオン交換カラムで粗精製した後に、往復循環クロマトグラフィー法で7種類のミトコンドリアtRNAを精製した。得られたtRNAを各種RNaseで消化した後、キャピラリー液体クロマトグラフィー質量分析法で解析を行った。tRNA^<Asn>はアンチコドン2字目にpseudouridine(Ψ)が見つかり、この修飾がAAAコドンをAsnに解読するしくみであると考えられた。tRNA^<Ser>のアンチコドン1字目から7-methylguanosine(m^7G)が見出され、この修飾がAGRコドンをSerに解読することを可能にすると考えられる。tRNA^<Trp>のアンチコドン1字目から5-taurinomethyl-2-thiouridine(τm^5s^2U)が見つかり、UGAコドンがTrpに解読する機構が明らかとなった。さらに、tRNA^<Lys>から新規の修飾体が見出されたので、現在、その化学構造の同定を行っている。

【研究分担者】
稲田利文	東北大学	薬学研究科	教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
鈴木勉	東京大学	大学院工学系研究科	教授	(Kakenデータベース)
横堀伸一	東京薬科大学	生命科学部	講師	(Kakenデータベース)