Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

超好熱性アーキア / Thermococcus / 代謝改変 / 水素 / 微生物工学 / 超好熱菌 / アーキア / TCAサイクル / メタボローム解析 / 生物・生体工学 / 水素生産

絶対嫌気性超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisはデンプンやピルビン酸の酸化分解と共役したプロトン還元により水素を発生させるが、これら基質はアセチル-CoAを経て最終的に酢酸として排出される。T. kodakarensisはC6カルボン酸を変換する酵素群を有しておらず、アセチル-CoAを代謝するTCAサイクルは機能していないと考えられているが、これら酵素群を有している超好熱菌も存在する。本研究では、T. kodakarensisに超好熱菌由来の耐熱性C6カルボン酸変換酵素群を導入し、TCAサイクルを駆動させることによる生育および物質生産能への影響を解析した。

ゲノム発現 / 超好熱菌 / 始原菌 / アーキア / 遺伝子破壊 / 環境適応 / 発現制御 / シグナル伝達

超好熱始原菌は少ない遺伝子数にもかかわらず外的環境の変化に自律的に適応できる生物であり、その極限的な環境の変化に応答する機構は興味深い。本研究では超好熱始原菌Thermococcus kodakarensisの環境適応における遺伝子発現制御機構の解析を行った。DNA結合因子依存型の発現制御としてNikRによるNi^<2+>輸送レギュロン、Phrによる熱ショック応答レギュロンを同定した。またDNA結合因子非依存型の発現制御として本菌のキチン代謝遺伝子群の発現を抑制するPINドメインタンパク質とその上流にコードされる機能未知タンパク質に着目し、これらによる制御が他の多数の遺伝子におよぶこと、および両タンパク質が相互作用して複合体を形成することを見出した。また推定プロテインキナーゼの遺伝子破壊により発現量が変動するタンパク質スポットが多数同定され、タンパク質リン酸化ネットワークによる発現制御系が超好熱始原菌にも存在することが示唆された。

超好熱菌 / 始原菌 / アーキア / ゲノム / 超好熱性 / 遺伝子破壊

超好熱菌(hyperthermophile)は90℃以上でも生育可能な微生物であるが、生物がなぜこのような高温環境で生育し増殖できるのかという命題は極めて興味深い。これまでにタンパクの高い熱安定性、エーテル脂質・tRNAの特異修飾などが指摘されているが、実際には数多くの要因からなる相加的・相乗的な効果により超好熱性が達成されているものと推測される。本研究では我々が独自にゲノム解析した超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1株を研究対象とし、高温感受性株の解析などから超好熱性を付与する遺伝子を多数同定することを目指す。
T. Kodakaraensisの利点は形質転換手法が確立されており、遺伝学的手法を駆使できることである。上述の高温感受性株の単離のために、まず超好熱菌ではこれまで例のないトランスポゾンによるランダム変異ライブラリーの作製を試みた。挿入配列による変異頻度が高いことが知られている好酸好熱菌Sulfolobus solfataricusおよび複合型トランスポゾンが挿入されている超好熱菌P. furiosusからtransposase遺伝子のクローニングおよびT. kodakaraensisにおけるトランスポゾン変異を試みているが、現在までにトランスポゾンの転移は確認できていない。今後、transposase遺伝子を強制発現させるプロモーター領域の導入やtransposaseが認識する反復配列、ベクターのデザインについて検討を加える。
一方、T. kodakaraensisを含む超好熱菌にのみ存在し、常温生物や好熱菌には存在しない遺伝子として染色体DNAのポジティブコイル形成を促進するreverse gyrase (Rgy)が知られている。そこでT. kodakaraensisのrgy遺伝子の破壊を試みたところ、破壊株を取得することができた。さらにrgy破壊株は80℃以上の高温において顕著に比増殖速度が低下し、野生株が生育可能な93℃では増殖しなかった。これらの結果はrgyが超好熱性の発現に重要な遺伝子であるものの、90℃までの環境では必須ではないことを示している。これは生命がどのような環境で生まれたかを考察する上でも興味深い結果と言える。

超好熱菌 / 始原菌 / アーキア / ゲノム / Missing gene / 機能未知遺伝子 / 遺伝子破壊 / トランスポゾン

90℃以上でも生育可能な超好熱菌においては生育に必須な機構や代謝を構成する遺伝子群がそのゲノム中に見いだされても、その一部は相同性解析から全く同定できない"missing gene"となっているケースが多い。本研究では、T.kodakaraensisのゲノム情報と遺伝子操作技術により本菌の2.09Mbpゲノム上に散在する"missing gene"の同定と機能検証を進めた。
昨年度までに引き続き、超好熱菌ではこれまで例のないトランスポゾンによるランダム変異法の確立を試みた。好酸好熱菌S.solfataricusのトランスポゾン転移株から単離したトランスポザーゼ(TPase)遺伝子、および近縁のP.furiosusの推定TPase遺伝子を種々のプロモーター領域の下流に配置したトランスポゾンベクターを新たに作製した。これらを用いてT.kodakaraensisトリプトファン要求性株におけるtrpEマーカ0の転移を試みたが、明確なトランスポゾンによる転移の確認はできなかった。今後はTPase遺伝子の発現の確認や、in vitroでの転移活性の確認を行い、最終的に超好熱菌におけるトランスポゾン変異の確立を目指す。
一方、T.kodakaraensis有機酸代謝経路において"missing gene"であるスクシニル-CoAシンテターゼ(SCS)が、アセチル-CoAシンテターゼI(ACSI)およびACS IIのパラログであることを見出した。特にSCSとACS IIは共通のスモールサブユニットに異なるラージサブユニットが会合することにより異なる基質特異性と機能を実現していることを明らかにした。また通常は糖新生酵素であるホスホエノールピルビン酸シンターゼが超好熱菌の解糖系において必須であることを遺伝子破壊により証明した。

【研究分担者】
金井保	京都大学	大学院・工学研究科	講師	(Kakenデータベース)

【研究協力者】
野原健太