Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

Saccharomyces cerevisiae / Yarrowia lipolytica / phospholipid uptake / acyl chain remodeling / phosphatidylethanolamine / phosphatidylcholine / cytochrome P450ALK / alkane hydroxylation / アルカン資化酵母 / 脂質代謝 / チトクロームP450 / パーオキシソーム / Candida maltosa

酵母の脂質動態と代謝に関わる細胞機能について以下のような研究成果を得た。
1.Saccharomynes cerevisiaeに取り込ませた安定同位体標識を付した短鎖リン脂質はホスファチジルエタノールアミン(PE)とホスファチジルコリン(PC)ともに短鎖アシル鎖が通常の酵母の脂肪酸アシル鎖に置き換えらており、その中間体として短鎖アシル鎖と通常アシル鎖の両方有する標識リン脂質が検出された。これらのリン脂質の細胞内への取り込みにはLEM3遺伝子産物が調節因子となっているP-型ATPaseが関わること、さらに、PEの場合にはSLC1とALE1によってコードされる2種のリン脂質sn-2位に特異的なアシルトランスフェラーゼが関わることが示唆された。かくして、酵母は膜リン脂質のアシル鎖を変換する活性を持ち、その点高等真核生物と共通である。
2.アルカン資化酵母Yarrowia lipolyticaではアルカン存在下に活性化因子Yas1pとYas2pがアルカン誘導性遺伝子のプロモーター上にあるARE1に結合して転写を活性化する。新たに抑制因子Yas3を発見した。この因子はアルカン存在下では小胞体に局在し、アルカンが無いと、核に局在した。Yas3pのS.cerevisiaeにおけるオルソログOpilpは小胞体に結合する時にホスファチジン酸(PA)への結合が想定されているので、Yas3pにタグを付け、PAへの結合性を調べたところ、やhり、PAに特異的に結合した。これらの研究を通して、アルカンの有無によって特定のリン脂質の量が変動し、それが、Yas3pの局在をコントロールする可能性が示された。アルカンのような強い疎水性の物質による調節を解明する重要な手がかりが得られた。

グリセロリン脂質 / ホスファチジルコリン / ホスファチジルエタノールアミン / 脂質二重層 / Saccharomyces cerevisiae / 脂質二重膜

生体膜脂質の最も基本的なものはグリセロリン脂質である。本研究では、酵母由来のリン脂質合成系酵素と細胞成分を用いて、真核生物の代表的グリセロリン脂質であるホスファチジルコリン(PC)とホスファチジルエタノールアミン(PE)を含む二重層膜の、前駆体からのin vitro合成系の作製を試みた。
エタノールアミン(Etn)からPEを合成するKennedy経路中でCDP-Etnの合成を触媒するCTP : phosphoethanolamine cytidylyltransferase(ECT)は経路の特異性と速度を決定する重要な酵素である。ECTをコードする遺伝子ECT1を操作して6xHis tagを付加した酵素を大腸菌中で生産し、これを精製して結晶化に成功した。放射光を利用する回折像から、その3次元構造を得た。また、アミノ酸置換変異を有するECTを複数種つくり、その酵素機能を解析中である。CDP-EtnからPEを合成する段階の遺伝子EPT1をクローン化し、酵素生産系を作成中である。
酢酸生産菌Acetobacter acetiはPEのアミノ基をメチル化してPCを合成する。これは可溶性酵素であり、酵母の2種のPE methyltransferaseが膜結合酵素であってそれぞれ単独ではPCまでの3段階の反応を全て触媒する力が弱いのに比べ、単一の酵素で、PCまで合成可能である。そこで、この細菌の酵素遺伝子をクローン化し、glutathione S-transferase遺伝子を付加した融合遺伝子を作製して大腸菌中で生産、glutathione-Sepharoseカラムによって活性ある融合タンパク質を精製した。現在PEを含むリポソームにこの酵素を作用させ、PEからPCへのリン脂質極性基の変換を試みている。
以上、補欠採択ということもあって時間が足りず、当初目的が達成されたわけではないが、目的とする膜の合成に必要ないくつかの酵素を調製中であり、計画は進行中である。

【研究分担者】
堀内裕之	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	准教授	(Kakenデータベース)
福田良一	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助教	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
福田良一	東京大学	大学院・農学生命科学研究科	助手	(Kakenデータベース)