【研究分野】形態・構造

【研究領域課題番号】15570052 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 細胞移植 / 副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 器官形成 / 多能性幹細胞 / 細胞移動

【研究成果の概要】

哺乳動物の副腎は中胚葉由来の皮質と外胚葉由来の髄質からなる。両者は発生の過程で合流し一つの臓器を形成する。副腎皮質には、同心円状に存在する3種類の細胞層(球状層、束状層、網状層)が存在し、それぞれ層特異的に鉱質、糖質コルチコイドおよび副腎性アンドロゲンを生成する。これら細胞層に対して、皮質全層を貫いて放射状に並ぶ細胞群は、系譜を同一とする細胞の集団であることが示されている。しかし、細胞層構築のない胎生期の状態から、成熟組織に認められる放射状のクローナルな細胞集団の形成過程は明らかでない。
本研究は、ラット胎生期から機能分化細胞層の形成過程における細胞の配列・配置の機構を明らかにすることを目的とした。我々は、既に副腎皮質に未分化細胞層(zU)を確認しているが、「多能性の幹細胞を含む層である」を確実に証明するに至っていない。しかし、このzUと共通の性質を保持する細胞株樹立の成功はこの細胞株に高発現するAZ-1(adrenocortical zonation factor-1)の同定に繋がった。AZ-1の発現は球状層に存在する鉱質コルチコイド産生酵素の発現とは相関的に、束状層に存在する糖質コルチコイド産生酵素の発現とは逆相関的関係にあり、AZ-1は副腎皮質の層別機能局在を規制する因子の一つと考えられた。
更にAZ-1は、in situ hybridizationの結果からzG/zUで生合成されるが、免疫組織化学的には、球状層では細胞塊の周りにアーク状に、また、zFRでは東状の細胞配列に平行して存在する洞様血管に沿って局在することが判明した。AZ-1分子は、分泌シグナル配列の他に広義のEGF様配列、および触媒残基が置換したprocathepsin B様配列を有する。よって、AZ-1は、細胞と細胞外マトリックスとをつなぐ因子である可能性、あるいは、細胞外の基質分解に関与し、細胞の接着・運動を制御する因子である可能性も予測された。事実、AZ-1タンパクは副腎において細胞外マトリックスであるラミニンやコラーゲン、フィブロネクチンの局在とほぼ一致した。更に、胎生期後半から成熟期に至る副腎におけるAZ-1タンパクの局在は、常にラミニンの局在と類似して観察された。ラット胎仔期から成熟過程の副腎における血管系形成は、そのごく近辺に細胞外マトリックスの発現とAZ-1の発現を伴っていた。副腎皮質の三層は共に中胚葉由来ではあるが、zU付近で誕生する副腎皮質の未分化細胞は、細胞それぞれの最終分化までにAZ-1などの助けを借りながら血管系に沿った細胞の移動があるものと考える。今後、これらの確固たる裏付けが必須となる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】13680724 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 組織形成 / 器官形成 / 幹細胞

【研究成果の概要】

副腎皮質は、異なるステロイドホルモンを産生する3種類の分化した細胞層を含む。我々は近年、齧歯類の成熟副腎皮質の球状層と束状層の間に、副腎皮質の幹細胞層と推定される細胞層を発見した。最近、この未分化細胞層と共通の性質を持ち、分化能を保持した細胞株を樹立した.未分化状態の副腎皮質細胞には、細胞の増殖・分化の制御に重要な分子が特異的に発現している可能性がある。そこで未分化細胞株に特異的な蛋白質の同定を行った結果、新しい分泌蛋白質(Adrenocortical zonation factor-1,以下AZ-1と記す)を同定した。この蛋白賞は、分泌シグナル、EGF様配列、プロカテプシンB様配列から構成された。mRNAの解析により、AZ-1の発現レベルは、副腎皮質における最終分化マーカーであるコルチコステロン合成酵素(Cyp11b-1)の発現レベルと逆相関することが判明した。この関係は、AZ-1のクローニングに用いたCyp11b-1の発現レベルの異なる細胞株群、Cyp11b-1を発現する細胞へAZ-1遺伝子の導入を行って得た細胞株群、副腎皮質組織の3種の系で成り立っていた。組織化学的な解析により、副腎皮質内でAZ-1は球状層で生合成・分泌され、全層の実質細胞の周囲に検出されることが判明した。AZ-1の局在は、細胞外マトリクス蛋白質のそれと一致した。一部の細胞外マトリクス蛋白質に対するAZ-1の結合を解析した結果、AZ-1は、フィブロネクチンとの結合能が判明した。AZ-1は他の臓器にも発現していることから、組織一般の形成、維持における本蛋白質の役割が解明されれば、組織損傷の治療法、がん細胞の増殖、転移の抑制の治療法等の開発のために本蛋白質の利用が考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】生物形態・構造

【研究領域課題番号】13640668 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 細胞移植 / 副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 器官形成

【研究成果の概要】

副腎皮質は、球状層、束状層、網状層と呼ばれる三層から構築される組織である。各層は異なる作用を持つステロイドホルモンを産生する。皮質全体として細胞の増殖、除去が定常的に行われる組織であるが、これまで幹細胞の同定はなされていない。近年、我々は球状層(zG)と束状層(zF)の間に、未分化でかつ増殖性を有する細胞からなる細胞層(zU)を見出した。そしてこの細胞層は多能性の幹細胞を含み、それが分化・増殖してzGとzFRの細胞を生じるとの仮説を提唱した。本研究は、この仮説を証明するため、副腎皮質から得られた単一クローンからなる未分化細胞集団を用い、この細胞から分化した副腎皮質細胞が生じるか否かを示すことを目的とした。
13年度は温度感受性SV40T抗原を発現するトランスジェニックマウス副腎から樹立した細胞株のうち、zU細胞と同様な性質を保持している上述の細胞株の性質を詳細に検討した。その結果、この未分化な細胞株に特異的に発現する新規分泌蛋白質を同定した。この蛋白質はN端から分泌シグナル、EGF様配列、プロカテプシンB様配列で構成され、間質性尿細管腎炎の抗原として同定されたウサギTIN-agと高い相同性がある。TIN-agは、細胞外マトリックス蛋白質として腎臓の尿細管の形成に重要であることから、本蛋白質も副腎皮質の形成に関与することが予測された。このzU細胞を移植に伴う拒絶反応のないscidマウスの腎臓被膜下に移植し副腎皮質の形成を試みたが成功には至っていない。14年度は新規分泌蛋白質の副腎内での役割を検討した。本蛋白質の発現ベクターをY-細胞株に導入するとY-1に存在するzFの機能マーカーであるP45011βの発現を抑制することが判明した。本蛋白質はadrenocortical zonation factor-1(AZ-1)と命名された。マウス副腎におけるAZ-1はzGおよびzUで生合成されるのに対し、転写産物である蛋白質は副腎皮質の全層、とくに血管構築に沿って認められたことから生合成と局在の部位が異なることも判明した。このzU細胞株はラミニンやコラーゲンIVを主成分とするMATRIGELの存在下ではT抗原の許容温度である33度でも分化し、zFマーカー遺伝子を発現した。AZ-1の細胞外マトリックス成分としての作用は副腎皮質三層の形成と維持に重要であると考えられる。現在、このzU細胞の個体へ移植を引続き試みるとともに、zU細胞株のzG細胞への分化を検討中である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】12470030 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 組織形成 / 器官形成 / 幹細胞

【研究成果の概要】

哺乳動物の副腎皮質は、球状層、束状層、網状層の3層から成る。我々は、近年3層に加えて、球状層と束状屈の間に未分化な細胞層(未分化細胞層)を見い出した。その後の解析から、未分化細胞層は、多能性の幹細胞を含み、分化・増殖して球状層と束状眉の細胞が生じるとの仮説を提唱した。12年度は、温度感受性SV40T抗原遺伝子をトランスジーンとして持つマウス副腎から、未分化細胞冠と同様な分化形宜を示す細胞株AcA101を樹立した。未分化細胞株AcA101は、非許容温度でdibutyryl cAMPの存在下で培養することにより、束状層マーカー遺伝子の発現が誘導されることが判明した.従って、未分化な状態から、束状屈様に分化することが判明した。未分化細胞株に加えて、束状層細胞様に分化した形質を示す細胞株も得られた。
未分化状態の副腎皮質細胞には、細胞の増殖・分化の制御に重要な分子が発現している可能性がある。13年度には、未分化細胞株に高発現し、分化した細胞に低発現する遺伝子の同定を行った。その結果、新しい分泌蛋白質を同定した。この蛋白質は、EGF様配列、プロカテプシンB様配列から構成された。このような構造から、本蛋白質が、細胞外における情報伝達、細胞外基質等の分解に関与することが推定された。本蛋白質を束状層様の細胞株に発現させ、分化状態を解析したところ、束状層の分化マーカー遺伝子(コルチコステロン合成における最終段階の酵素)P45011betaの発現が抑制された。この結果は、新規蛋白質の発現により、細胞層特異的なステロイド合成酵素遺伝子の発現が抑制されることを示す。従って、未分化細胞株から同定した新しい分泌蛋白質は、in vitroで最終分化形質を抑制しうることを示す。本蛋白質は、他の臓器にも発現しており、今後の研究により組織一般の形成、維持における役割の解明が重要と思われる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】14,500千円 (直接経費: 14,500千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】10680621 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 器官形成 / 幹細胞 / 組織形成

【研究成果の概要】

哺乳動物の副腎皮質はそれぞれ鉱質コルチロイド、糖質コルチロイド、および副腎性アンドロゲンを分泌する球状層、束状層、網状層の3層からなる。我々は、これら3層に加えて、球状層と束状層の間に皮質の幹細胞を含むと思われる未分化な細胞層(以下、未分化細胞層)を近年新たに見いだし、未分化細胞層から分化・増殖して、球状層と束状層の細胞が生じるとの仮説を提唱した。この仮説を証明するため、最近我々は未分化細胞層の性質を持つマウス副腎皮質細胞株を樹立するに成功した。
10年度は、未分化な状態を保っている細胞株に特異的に発現している蛋白質のcDNA単離を試み、転写調節蛋白質、転写コファクター、細胞間マトリクス蛋白質と相同性のある蛋白質をコードするcDNAを複数単離した。これらは、遺伝子の発現調節、細胞間相互作用に関与することから、発生・分化に重要な役割を持ちうる分子であることが期待される。
11年度は、これらの分子の細胞内発現部位の同定および、機能解析を進めた。これらのmRNAの発現を、マウスの主な臓器から調整したRNAを用いてノザン解析した。その結果に基づき、副腎での発現量が多い分子2種について、in situ hybridizationにより組織内発現分布を解析した。一方は、未分化細胞層から球状層に局在した。他方は、未分化細胞層から束状層外側に局在した。さらに、このような局在と皮質細胞のステロイドホルモン産生機能、および、増殖能の関連を調べるため、層機能マーカー分子の局在、および、DNA合成細胞の分布を免疫組織化学的に解析した。その結果、2種の分子の局在は、それぞれ、球状層細胞の分化・増殖、および、束状層細胞の分化・増殖が活発な部位とよく一致することが判明した。以上の結果は、これらの分子が副腎皮質組織の形成・維持に関与していることを示す。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】07670153 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

副腎皮質 / アルドステロン合成酵素 / ステロイド11β-水酸化酵素 / 幹細胞 / 副腎皮質の層別機能

【研究成果の概要】

副腎皮質は、その起源が同じ中胚葉でありながら、その外側から内側へ向けて機能的にも形態的にも異なる球状層、束状層、網状層の三層にわかれ、それぞれ鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド(GC)および副腎性アンドロゲンを分泌する。近年我々は、ラット副腎皮質の球状層と束状層の間に機能未知なる第四の細胞層を見いだし、これが副腎皮質の幹細胞性細胞であることを示唆する結果を得た。本研究は、この幹細胞の性質を持つ新しい細胞層がいかなる制御機構で層特異的に分化し、皮質三層の形成に寄与しているかを免疫組織学的、分子生物学的に解明することに主眼をおいた。先ず、副腎皮質の機能調節因子であるACTH及びアンギオテンシンII(AGII)の長期刺激(20日間)に対する応答について解明を試みた。機能未知層は上記いずれかのホルモンの長期刺激下ではコントロールラットと同様に有意に存在したが、両ホルモンの同時刺激下では殆ど消失した。更にDNA合成期の細胞の分布はAGII刺激下では機能未知層の上縁、即ちアルドステロン合成酵素の発現を伴って厚みを増している球状層の下縁であり、ACTH刺激下では、機能未知層の下縁、即ち、GC合成酵素の発現を伴って厚みを増している束状層の上縁であった。これらの結果は、AGIIおよびACTHのいずれの刺激下においても機能未知層およびその付近において、細胞数の変化が起こると共に増殖中の細胞が集中することを示しており、機能未知細胞層が幹細胞層であるとする仮説と矛盾しなかった。同時に、幹細胞がAGIIまたはACTHの刺激でアルドステロン又はGC産生細胞に変わりうる可能性を示している。次いで、胎仔から新生仔にかけて副腎組織の構築過程を検討した。出生前では、皮質、髄質及び機能未知層の細胞が混在して観察されたが、出生後3日もすると、髄質細胞は副腎の中心に集まり、しかも機能未知細胞層を有する皮質の層形成が観察された。また副腎にenucleationを施し、球状層及び機能未知細胞層を含む被膜部分のみを体内に残すと一箇月ほどで副腎皮質は再生に皮質三層が再構築された。今後、細胞の遺伝子マーカーとなるlacZ遺伝子を持つレトロウイルスベクター系の導入、さらには機能未知細胞の分離と培養系の樹立などにより、幹細胞性細胞の系譜を詳細に検討する。

【研究種目】一般研究(C)

【研究期間】1995

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)