【研究領域課題番号】20H03175 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゴールデンハムスター / 機能性RNA / 生殖細胞 / ゲノム編集 / エピジェネティクス / トランスポゾン / 遺伝子発現制御 / 小分子RNA / PIWI / piRNA

【研究成果の概要】

哺乳類のPIWI遺伝子はpiRNAとともに雄の生殖細胞でトランスポゾンの抑制分子として機能することが知られている。これらの知見はマウスを用いた研究から明らかにされたものである。ところが、ヒトをはじめとするほとんどの哺乳動物は雌の生殖細胞にもPIWI遺伝子を強く発現しており、マウスよりも1つ多くPIWI遺伝 子を有する。申請者はこれまでに雌の生殖細胞で強く発現するPIWIL1とPIWIL3を見出し、それらの分子特性をあきらかにしている (Nucleic Acid Research, vol. 49, 2021)。本年度はゲノム編集によりPIWIL1とPIWIL3を欠損させたゴールデンハムスターを用い、個体レベルにおけるPIWI遺伝子の解析を進めた。その結果、PIWIL1を欠損した雌のゴールデンハムスターは不妊となることを明らかにした。また、その原因は母性に発現するPIWIL1が無いと２細胞期までしか発生しないことであることがわかった。一方で、マウスでは存在しないPIWIL3を欠損したゴールデンハムスターの雌も不妊傾向が強いことを明らかにした。PIWIL3を欠損した卵子由来の胚は、発生が遅くなったり、発生の途中で一部の割球のみの卵割が止まったりすることを見出した。これらの結果から、卵子で強く発現するPIWIL1は胚発生に必須であること、PIWIL3は必須でないが胚発生時に機能しており、マウスでは明らかにできなかった雌におけるPIWI遺伝子の重要性を明らかにした。さらにこれらのことは、ゴールデンハムスターが新しいヒト疾病モデルとなることを示し、Nature Cell Biology, vol. 23, 2021に報告した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究領域課題番号】18H03982 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

piRNA / PIWI / 反応場

【研究成果の概要】

piRNA生合成の最終過程となる3'末端の削り込み反応を担うエクソヌクレアーゼTrimmerを、CRISPR/Cas9を用いてノックアウトしたカイコBmN4細胞の樹立に成功した。その結果、本来28塩基程度の長さを持つ成熟piRNAはほとんど検出されなくなる一方で、32-42塩基程度のpiRNA前駆体と思われるものが蓄積することが確認された。そこで、それらのpiRNA前駆体様のRNAを次世代シーケンサーを用いて解析したところ、3'末端がウリジン(U)の手前で切断されたと思われるものが比較的多く含まれていることが判明した。また、piRNA前駆体のすぐ後から別のpiRNAが作られやすいことも明らかとなった。これらの特徴は、Trimmerノックアウト時に蓄積している32-42塩基程度のRNAが、Trimmerの上流で働くと考えられているエンドヌクレアーゼZucchiniの切断直後の産物であることを示唆していた。
そこで、TrimmerノックアウトBmN4細胞から粗抽出液を調整し、試験管内でPIWIタンパク質に取り込ませた長いRNAに加えてみたところ、たしかに成熟体piRNAよりも少し長いところでRNAが切断されること、また、この切断は弱いながらもUの手前を好むことが確認できた。
以上のことから、エクソヌクレアーゼTrimmerのノックアウト細胞抽出液を用いることによって、その上流ではたらくエンドヌクレアーゼZucchiniが生体内で本来持っている活性を忠実に再現できる試験管内系が初めて構築できた可能性が高く、今後piRNAの生合成過程を解析するに当たって有用なツールになると思われる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2019-03-31

【配分額】44,200千円 (直接経費: 34,000千円、間接経費: 10,200千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】17H06111 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

PIWI / piRNA / トランスポゾン / RNAサイレンシング / ショウジョウバエ / Piwi

【研究成果の概要】

トランスポゾンの利己的な転移活性による生殖ゲノムの損傷は種の保存を脅かすため、有性生殖を伴う動物は、進化の過程でpiRNAを中核因子とするRNAサイレンシング機構を自己防衛手段として獲得したと考えられている。しかし、その動作原理は未だ不明である。本研究では、piRNAの動作原理を明らかにすることを目的とした。piRNAは、piRNAクラスタから転写された前駆体から生成されるが、piRNA生合成の仕組みは未だ明らかになっていないため、その解明に取り組んだ。piRNA生合成の必須因子としてArmitageが知られる。ArmitageのRNA結合様式を調べたところ、通常の状態ではArmitage はpiRNA前駆体に特異的に結合するが、上流因子Ybが存在しない場合は様々な細胞内RNAに結合してしまい、また、これらのRNAからトランスポゾン抑制の機能をもたないpiRNAを作り出してしまうことが判明した。つまりYbはArmiのRNA結合の特異性を制御する因子であり、ArmitageはpiRNA生合成を促進する因子であることが判明した。この成果はCell Reports誌に報告した。並行してpiRNA生合成の場として知られるYb bodyの形成機構及び要求性に関して研究を進めた。Yb bodyに局在する因子としてはYb、Armitage、SoYb、Vretが知られる。本解析から、YbのRNA結合能があればYb bodyが形成されること、その形成後は、Armi、Soyb/Vretの順番でタンパク質相互作用を介してYb bodyに順次局在することがわかった。Yb bodyが液相分離によって形成されることも判明した。この成果はEMBO Reports誌に報告した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2017-05-31 - 2020-03-31

【配分額】202,540千円 (直接経費: 155,800千円、間接経費: 46,740千円)

【研究分野】システムゲノム科学

【研究領域課題番号】17K15051 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

piRNA / PIWI / transposon / RNA binding protein / ChIRP-MS / OSC / ハエ / flamenco / トランスポゾン / RNA結合タンパク質 / ChIRP

【研究成果の概要】

piRNAは生殖細胞においてトランスポゾンの抑制に必要な小分子RNAであり、piRNA経路の破綻は不妊を引き起こす。piRNAは前駆体RNAから生成されるが、前駆体RNAが選定されるメカニズムは十分明らかでない。これまで前駆体RNA中にpiRNAの産生に必要十分である決定配列が存在することが報告されているが、決定配列がどのようなタンパク質と結合するのかはほとんどわかっていない。本研究では、決定配列に結合するタンパク質をChIRP-MSという手法で網羅的に同定し、新規因子を含む192のタンパク質候補が得られた。これらのタンパク質はpiRNA産生の鍵となる有力な候補群となることが期待される。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】17H03632 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

piRNA / Armi / Piwi / Zuc / GasZ / レトロトランスポゾン / RNAサイレンシング / CLIPPARE / Yb / RNA silencing / Armitage / iCLIP / RNA helicase

【研究成果の概要】

piRNAは、相補的な配列を持つ遺伝子の発現を抑制する生殖細胞特異的な機能性小分子RNAである。申請者は、ショウジョウバエを用いたpiRNA生合成因子探索の結果、ATP依存性RNAヘリカーゼであるArmitage（Armi）を同定した。本研究により、細胞内でArmiに結合するRNAをiCLIP法および独自に開発したCLIPPARE法により解析することで、これまで詳細な解析がされていなかったpiRNA生合成遷移過程を捉えることが可能となった。また、生化学的解析により、piRNA生合成経路の詳細な分子メカニズムを解明した。

【研究の社会的意義】

piRNA生合成経路は、関連因子が多い複雑な分子機構であり、その中間過程に関する知見が全容解明には不可欠である。本研究では、近年開発された技術を取り入れ、関連因子の細胞内局在と機能、プロセシング過程の中間体配列に関する解析を行い、piRNA生合成経路の包括的な理解を深め、成果を上げてきた。さらに、本研究ではCLIP法を応用した新たな配列解析手法を確立した。この新たな手法による中間体解析が、今後もpiRNA生合成経路の全容解明に寄与すると期待している。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】15H05585 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

piRNA / Piwi / CRISPR / tj / 翻訳 / RNA二次構造 / CRISPR-Cas9 / RNAサイレンシング

【研究成果の概要】

ショウジョウバエ培養細胞株OSCでは、piRNAは一次生合成経路により生成され、Piwiタンパク質に結合する。piRNAは主に転移因子に由来するが、一部のpiRNAはmRNAの3'UTRにコードされている。これまでに、多くのpiRNAを産生するTraffic jam(Tj)の3'UTRにおいて、100塩基長のpiRNA生合成に必須のシス配列が同定された。SHAPE法と呼ばれるRNA二次構造解析法により、このシス配列が特異的な構造を持つことが示唆された。構造変異体ではpiRNA生合成活性が失われたことから、シス配列の構造的特徴がpiRNA生成に必須であることが示唆された。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】23,530千円 (直接経費: 18,100千円、間接経費: 5,430千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】25221003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生殖細胞 / エピジェネティクス / クロマチン / トランスポゾン / Piwi / piRNA / エピゲノム / RNAサイレンシング

【研究成果の概要】

哺乳類生殖エピゲノム形成機構の解析を行い、マウスゴノサイト期にメガベースサイズのクロマチン領域がダイナミックに変動することを見出しDAD (Differentially accessible domain) と名付けた。DADの形成に伴いその領域内のヒストンの修飾とDNAのメチル化が変化すること、さらに、DAD領域に存在する転移因子の転写が活性化されることを見出した。一方、ハムスターのPIWI遺伝子欠失個体（KOハムスター）の作製に成功した。PIWIL1 KO個体は雄雌共に不稔であった。これは、哺乳類におけるPIWI変異による雌不稔の初めての例であり、学術的な意義は大きい。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2013-05-31 - 2018-03-31

【配分額】218,140千円 (直接経費: 167,800千円、間接経費: 50,340千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】25840004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

piRNA / Piwi / RNAサイレンシング / RNA silencing

【研究成果の概要】

piRNAは相補的な配列を持つ転移因子の発現を負に制御する機能性小分子RNAである。申請者らは、ショウジョウバエpiRNA生合成機構に関する研究の過程で人工的に配列設計したpiRNAを生成できることを見出した。本研究では、人工piRNAによる遺伝子ノックダウン法の開発を目指した。ショウジョウバエ卵巣由来培養細胞において任意の配列を持ったpiRNAを生成することができる発現ベクターを作製し、内在遺伝子を標的とした人工piRNAを生成することで遺伝子発現が抑制されるかどうかを調べた。その結果、内在遺伝子のサイレンシングに成功し、この抑制がpiRNA経路により転写レベルで起こることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】25221101 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

PIWI / piRNA / トランスポゾン / RNAサイレンシング / ショウジョウバエ

【研究成果の概要】

PIWI-interacting RNA（piRNA）は正しい遺伝情報を次世代へと受継ぐ使命を担う生殖細胞でDNA損傷を引き起こす転移性因子トランスポゾンから生殖細胞のゲノムをまもる役割を担う。しかし、その動作原理は未だ不明である。本研究課題では、特に[I] piRNA生合成と[II] piRNAによる核内サイレンシングの仕組みに焦点を絞り解析を進めることによってpiRNA機構の全貌解明を目指した。また、[III] 人工piRNAを産生する仕組みの構築および人工piRNAによる任意遺伝子の抑制も目指した。いずれの項目においても当初の計画以上の進展があり、複数の論文として発表することができた。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2013-05-31 - 2018-03-31

【配分額】208,390千円 (直接経費: 160,300千円、間接経費: 48,090千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】23658221 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

繁殖 / 卵成熟 / PIWI / piRNA / 応用動物 / 畜産学

【研究成果の概要】

ブタ卵には少なくともPIWIL1とPIWIL2の2種のPIWI m RNAが存在し、これらのタンパク質発現を抑制すると高cAMP濃度で減数分裂が再開されることから、PIWIの卵巣内卵の減数分裂停止への生理的関与が示唆された。このPIWI機能はcyclinBの蓄積抑制を介しており、cyclin B mRNA量および翻訳制御に働くAuroraAやCPEBに変化が無いことからcyclin B分解系のAPC機能への関与が考えられる。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】基礎ゲノム科学

【研究領域課題番号】20221008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム機能 / RNAサイレンシング / 転移因子 / 小分子RNA / RNAi / ゲノム進化 / エピゲネティクス / 生殖細胞 / 生殖幹細胞 / Argonaute / piRNA / ゲノム / 進化 / Piwi / Yb Body / エピジェネティックス / エピジェネティクス / 転位因子 / RNA サイレンシング / 脆弱X症候群

【研究成果の概要】

「転移因子とRNAサイレンシング機構の間の'軍拡競争'が複雑な遺伝子発現制禦を可能にするゲノムの進化をもたらした」という仮説の検証をショウジョウバエを用いて行った。その結果、転移因子の抑制機構が体細胞では遺伝子の発現制御にも密接に関与していること、そして、生殖細胞では生殖幹細胞-体細胞相互作用や卵形成過程における軸形成に関与していることを示唆する結果を得た。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2008 - 2012

【配分額】213,330千円 (直接経費: 164,100千円、間接経費: 49,230千円)