【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】08406018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

トランスジェニック動物 / EGFP / PCR / DPnI / マウス胚 / トランスジェニック / 形質転換家畜 / 遺伝子導入 / α-ガラクトース / 制限酵素 / 蛍光蛋白 / 胚 / トランスジーン / シバヤギ / ホメオボックス / c-kit / SCF

【研究成果の概要】

1.シバヤギc-kit cDNAに見い出された特異的アラニン残基の挿入について、各種の動物を解析した結果、ウシ科の中でもヤギ、ヒツジに特異的な挿入であることが判明した。c-kitのリガンドであるSCFcDNAのクローニングを行なった結果、5つのisoformsが単離された。そのうちの二つは、従来報告されている動物種にない、新規のSCFのisoformsであった。2.マウスおよびシバヤギの胎盤形成過程におけるホメオボックス含有遺伝子群の関与について検討した。Degenerate oligonucleotide primeを用いたRT-PCR法による解析の結果、両動物種の胎盤において多数のホメオボックス遺伝子の発現が同定され、Hox a9,d9,Emx2.Msx2,ATBFIが、両動物種で共通して発現していた。また、Hox 09,d9の発現が胎盤形成過程において何らかの役割を果たしていることが示唆された。3.形質転換動物の作出効率を向上させる手段して、Bal 31とDpn IによるDNA消化とPCRとを併用したTg胚の選別を試みた。細胞質にDNAを注入し体外で後期胚に発生させたウシおよびマウス胚の98.6%で特異PCR産物は全く検出されなかった。一方、Tg胚のゲノムDNAを酵素処理した場合には、68.6%の胚でトランスジーンに特異的なPCR産物が検出された。また、70.5%のウシ胚でマーカー遺伝子に特異的なPCR物が検出され、Tg胚の選別に極めて有効であることが認められた。4.EGFPをマーカーとしてTg胚の選別法について検討した。受精卵前核にCMV・β-actin/EGFP遺伝子を顕微注入し生存胚を体外培養した。後期胚について蛍光顕微鏡で観察し、14.8%が胚全体で、22.6%がモザイク様の蛍光が観察された。つぎに、モザイク様に発光した胚と全体に発光した胚とに分類し偽妊娠ICRマウスの子宮へ移植した。前者から76.9%、後者から21.6%のTgマウスが得られた。本手法が、Tg胚の選別に極めて有効であることが認められた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】34,300千円 (直接経費: 34,300千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】07556063 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

トランスジェニック / トランスジーン / EGFP / 緑色螢光蛋白 / 胚 / PCR / 制限酵素 / Bal31 / Dpn I / シバヤギ / トランスジェニック胚 / 遺伝子導入 / エキソヌクレアーゼ

【研究成果の概要】

Tg家畜作出における最大の課題は、Tg動物の作出効率がマウスに比べ著しく低いことである。家畜への遺伝子導入は、これまで、受精卵前核へのDNA顕微注入法によってのみ行なわれているが、胚発生の階段で、Tg胚を選別できれば、Tg動物の作出効率を顕著に向上させることができる。最近、Green Fluorescent Protein(GEP)をマーカーとするTg胚の選別法が開発されつつあるが、なお、胚におけるGFPの一過性発現と持続性発現との区別が明瞭でない。本研究は、マウス胚を材料に、enhancedGFP(EGFP)をCMVenhance・chiken β-actin promoterに連結した融合遺伝子(CMV・β-actin/EGFP)をマーカーとした高精度のTg胚選別法を確立するために行なったものである。C3B6F1マウス由来の受精卵前核にCMV・β-actin/EGFP遺伝子を顕微注入し生存胚を体外培養した。その後、4細胞、8細胞、桑実胚、胚盤胞期に、それぞれ蛍光顕微鏡(GF-1フィルター)で観察し、後期胚について、モザイク様に発光した胚と全体に発光した胚とに分類した。それらの胚の一部を、我々の研究室で開発したBal31・Dpnlを用いるTg胚選別法(Soe et al,1997)により、蛍光発光とTg胚との関係について解析した。他の胚は、偽妊娠ICRマウスの子宮へ移植し、生まれたマウスのTg個体について解析した。なお、対照には非発光胚を用いた。4細胞期および8細胞期で蛍光発光が観察された場合もあったが、大部分は桑実期以後に強い発光が観察された。Soeらの方法によりTg胚を解析した結果、発光胚の約80%以上がTg胚と判定された。一方、非発光胚でも極一部Tg胚の存在が確認された。なお、移植実験の解析は現在進行中である。また、胚におけるEGFPの発現が、培養液の鮮度に強く影響されることが認められた。以上の結果から、EGFPをマーカーとするTg胚の選別には、全体に発光する胚のみをTg胚として判定することが重要であると考えられ、本選別法が、Tg家畜の作出効率を向上させる上で手極めて有効な手段であることが確認された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】19,100千円 (直接経費: 19,100千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】07456121 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シバヤギ / 胎盤 / ホメオボックス / PCR / c-kit / scF / isoforms / SCF

【研究成果の概要】

1.マウスおよびシバヤギの胎盤形成過程におけるホメオボックス含有遺伝子群の関与について検討した。degenerate oligonucleotide primers を用いたRT-PCR法による解析の結果、両動物種の胎盤において多数のホメオボックス遺伝子の発現が同定された。その内、Hoxa9,d9,Emx2,Msx2,ATBF1が、両動物種で共通して発現していた。また、Hox a9'd9に関して妊娠の進行とともにその発現量が増加し、これらの遺伝子の発現が胎盤形成過程において何らかの役割を果たしていることが示唆された。2.優性黒眼白色形質とc-kit との関連を調べる目的で、優性黒眼白色形質を表現しているシバヤギのc-Kit cDNAのクローニングを行なった結果、kinase insert領域に皮毛色と関係なくヤギ特異的アラニン残基の挿入が見出された。3.シバヤギc-Kit cDNA特異的アラニン残基の挿入について、ヒツジ、シカ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコのDNAを解析した結果、ウシ科の中でもヤギ、ヒツジに特異的な挿入であることが判明した。c-KitのリガンドであるSCFcDNAのクローニングを行なった結果、5つのisoformsが単離された。そのうちの二つは、従来報告されている動物種にない、新規のSCFのisoformsであった。今後は、これらのisoformsの生物学的意義について追求する予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】7,400千円 (直接経費: 7,400千円)