【研究領域課題番号】20K05954 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

tRNA / 翻訳 / タンパク質合成 / 遺伝暗号解読 / コドン / リボソーム

【研究成果の概要】

前年度では翻訳中ペプチジルtRNAの抽出法を確立させたが、レポーター遺伝子のテストコドンを解読したペプチジルtRNAのみを精製する方法を確立することができなかった。そのため、今年度は一部方針を変更し、各アミノ酸のコドンを1種類に限定したレポーター遺伝子を大腸菌細胞内または無細胞翻訳系で発現させ、抽出したペプチジルtRNAのtRNA部分を配列解析することによってアイソデコーダーの使用頻度を算出する方法の確立に取り組んだ。レポーター遺伝子は３種類設計した。また、前年度に課題となったペプチジルtRNA以外のtRNAの非特異的な混入を解決する方法として、選択的デアシル化とデアシルtRNAの3’末端処理を組み合わせることによってペプチジルtRNAのみをアダプターにライゲーションする方法を試行錯誤し、最終的にその確立に成功した。これらの方法を用いて、上記のレポーター遺伝子を大腸菌細胞または無細胞翻訳系によってそれぞれ発現させ、ペプチジルtRNAを抽出し、ＮＧＳ解析によって各tRNAの定量解析を行った。この時、tRNAプール中の各tRNAの存在量比を測定するため、未処理の全tRNA画分についても定量解析を行っている。その結果、無細胞翻訳系では、特定のアイソデコーダーtRNAにしか読まれないコドンを有したレポーター遺伝子ではそれぞれ対応するtRNAの相対量が顕著に高く検出されたことから、実験系が機能していることが証明できた。また、複数種のアイソデコーダーtRNAによって読まれるコドンについては、アイソデコーダーtRNAの使用頻度はtRNAプール中の存在比とは異なり、コドン種によって特徴があることが分かってきた。一方、大腸菌細胞のデータではそのような差が見られなかった。これはレポーター遺伝子の発現量が内在遺伝子の発現量を凌駕できずそれら由来のペプチジルtRNAによるものと考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究領域課題番号】18K06054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / 哺乳類ミトコンドリア / リボソーム / 新生ペプチド鎖 / ミトコンドリア / タンパク質合成 / ペプチドトンネル / cryoEM

【研究成果の概要】

本研究は、ミトコンドリアリボソームのペプチドトンネルの構造を明らかにし、新生ペプチド鎖とペプチドトンネルの相互作用について知見を得ることを目指すものである。哺乳類ミトコンドリア翻訳系を再構築し、連続プロリン配列を介した翻訳停止を利用して新生ペプチド鎖リボソーム複合体(ribosome-nascentchain complex, RNC)を形成することに成功した(Lee, 2021)。新生ペプチド鎖の長さについて検討したところ、新生ペプチド鎖の長さが約80アミノ酸以上でそのN末端がミトコンドリアリボソームのペプチドトンネルの外に露出することが明らかになった。

【研究の社会的意義】

近年、ミトコンドリアのリボソームや翻訳因子に誤作用して副作用をもたらす薬剤が多く報告されている。また、リボソームのペプチドトンネルは、新生ペプチド鎖のプロセシングや折りたたみ、細胞内輸送などの制御をになう場であり、ペプチドトンネルは多くの抗生物質の結合部位となっている。本研究により、新生ペプチド鎖の配列や長さを制御しながらミトコンドリアのRNCを調製することが可能になった。今後様々なRNCの構造を決定することにより、薬剤デザイン等に有用な知見が得られると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】神経生理学・神経科学一般

【研究領域課題番号】15K14311 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / 翻訳 / リボソーム / 神経 / 形態 / レポーター / GFP

【研究成果の概要】

本研究においては、神経の可塑性に関連すると考えられている細胞内タンパク質合成活性の変動を直接捉えることができるレポータータンパク質の開発を行った。測定時のシグナル強度がタンパク質合成を直接反映するように、タンパク質合成中のみに蛍光を発し、合成後に自己消化して消光するような人工レポータータンパク質を設計し、実際に自己消化機構が働くことを確認した。自己消化の効率を上げるためにリンカーの長さや、プロテアーゼ断片の配置や、蛍光タンパク質への変異導入などを行い、最適化を行った。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】25440004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / ミトコンドリア / 生体外タンパク質合成系 / タンパク質合成

【研究成果の概要】

本研究では、哺乳類ミトコンドリア蛋白質合成系の分子機構を理解し、薬剤デザイン等の医療応用へ貢献することを目指した。申請者が確立した再構築型哺乳類ミトコンドリアの翻訳システムを応用し、ミトコンドリアにユニークな翻訳終結因子ICT1の機能解析を行った。ICT1の基質特異性や機能部位を解析してその作用機序を明らかにするとともに、ミトコンドリアの変則的終止コドンの解読機構のモデルを提唱した。ミトコンドリアリボソームと翻訳因子の複合体のcryoEM構造解析を進め、PREおよびPOST-トランスロケーション複合体について高分解能の構造を決定した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】22570170 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / 遺伝暗号 / 原生生物 / 翻訳終結因子 / 翻訳 / コドン / 繊毛虫 / eRF1

【研究成果の概要】

繊毛虫類の終止コドン認識に関わるアミノ酸残基を同定することを目的とし、3つの終止コドンを認識するDileptusmargaritiferと変則的な終止コドン認識を行うEuplotesraikoviのeRF1の特定のアミノ酸残基を変異させ、酵母の系で認識能力を調べることにより、終止コドン認識に関わるアミノ酸残基を同定することを目指した。K25、R128、H134について調べたところ、eRF1ドメイン1の128番目のアミノ酸残基Rが、繊毛虫eRF1においてUGA認識に関わる重要な残基であると考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】17570140 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

浸透圧ストレス / グルコース飢餓 / アクチン / タンパク質合成 / 局所麻酔剤 / 抗精神病薬 / 浸透圧 / グルコース / 翻訳 / 界面活性剤 / ストレス / 酵母

【研究成果の概要】

グルコース飢餓や高浸透圧などの環境ストレスは出芽酵母で一過的な翻訳開始の停止やアクチン骨格の脱極性化を引き起こす。これらの反応は統括的に制御されており、未知の経路を介した急速な阻害反応と、Msn2/4転写因子、Snf1やHog1キナーゼなどの既存経路を介した適応反応の二つから構成されている。
テトラカインなど多数の局所麻酔剤が、高浸透圧やグルコース飢餓などの環境ストレスと同様に、出芽酵母でアクチン骨格の極性化や翻訳開始を急速に阻害する現象を見いだした。その薬剤効果は免疫抑制剤ラバマイシンに類似しているが、ラバマイシンの標的TORとは別経路で作用していることがわかった。またフルフェナジンなど多数の抗精神病薬も類似作用を持ち、麻酔剤より強力な阻害活性を示す事実も見いだした。阻害活性を持つこれら薬剤の構造を比較検討したところ、全て両親媒性構造を持ち、実際に界面活性能を持つ事を化学的に証明した。そこで代表的な両親媒性化合物である界面活性剤も多数調べた結果、陽イオン性界面活性剤が臨床薬剤と類似で、且つ最も強力な阻害活性を示すことがわかった。これらの薬剤の化学構造はそれぞれ大きく異なることから、出芽酵母での臨床薬剤の標的は特定の蛋白質というより細胞膜そのものであると考えられる。また界面活性剤は細胞溶解を引き起こさない低濃度でも阻害反応を起こす事から、臨床薬剤や環境ストレスによる統括的な阻害反応は細胞膜破壊が原因ではなく細胞膜の撹乱が引き金になると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】15570142 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

浸透圧 / グルコース / アクチン / タンパク質合成 / ストレス / 環境 / 情報伝達 / 翻訳

【研究成果の概要】

浸透圧ストレスやグルコース飢餓などの環境ストレスは出芽酵母のアクチン極性と全蛋白質合成を迅速且つ一過的に阻害する現象を見い出している。この現象を解明するため、本申請の期間中では主にグルコース飢餓による制御機構の解析を行った。
その結果、グルコース飢餓による制御は、まず翻訳開始とアクチン極性を統括して制御する機構と、それぞれを個別に制御する機構の二つから構成されており、統括制御機構は、急速な阻害反応と再活性化の二つの反応から構成されている事がわかった。この阻害反応にはA-キナーゼやReg1/Glc7プロテインフォスファターゼが関与することを明らかにした。再活性化はさらにグルコース非存在下での再活性化とグルコース再添加による急速な再活性化に分類され、グルコース非存在下での再活性化には呼吸能やMsn2/4転写因子、Snf1キナーゼが関与しているが、グルコース再添加による急速な再活性化にはこれらが関与しない新規のシステムが存在する事実を明らかにした。またグルコース飢餓による個別制御の機構として、翻訳開始の停止反応のみに関わる因子としてmRNAポリA鎖の分解に関与するPop2/Caf1遺伝子、またアクチンの脱極性化反応のみに関わる因子としてRho1-Pkc1キナーゼ経路を新たに同定した。これらのシステムはストレスに応じて空間的に配置された遺伝子発現パターンを迅速に再編成する為に必要であると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,000千円 (直接経費: 3,000千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】13780548 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

浸透圧 / グルコース / アクチン / 翻訳 / ストレス / タンパク質合成 / 翻訳開始 / MAPキナーゼ / HOG1

【研究成果の概要】

浸透圧ストレスは出芽酵母の翻訳開始を一過的に停止させ、アクチン骨格も一過的に脱極性化する。申請者は培地からのグルコース除去も翻訳開始の急速な停止だけでなくアクチン骨格の急速な脱極性化を引き起こすが、それらの反応も一過的である事実を見い出した。これは翻訳開始とアクチン骨格の両者が環境ストレスにより同時に制御される機構の存在を示している。この制御機構を明らかにするため、グルコースによるアクチン骨格の極性と翻訳開始の挙動を解析した。
グルコースによる遺伝子の転写抑制に必要なA-キナーゼの変異株(tpk1w)やGlc7ホスファターゼの制御サブユニットの破壊株(reg1)では、グルコース除去後の急速な翻訳開始の停止やアクチン骨格の脱極性化は起こらなかった。またアンチマイシンAにより呼吸を阻害した野生型株、グルコースによる転写の脱抑制に必要なSnf1キナーゼやMsn2/4転写因子の遺伝子破壊株では、グルコース除去後の急速なアクチン骨格の脱極性化や翻訳開始の停止は起こるが、その後の再極性化や翻訳再開は起こらなかった。しかし呼吸阻害条件下でもグルコース飢餓細胞にグルコースを再添加するとアクチン骨格の急速な再極性化が起こった。グルコース再添加による細胞内cAMPの一過的上昇が起こらないGpr1グルコースレセプターやGpa2 GTPaseの遺伝子破壊株でも、この再極性化は正常に起こることから、cAMPの一過的上昇はこの反応には関係ない。従ってグルコースによるアクチン極性と翻訳開始の制御は、(1)A-キナーゼやReg1が関与するグルコース除去後の急速な停止、(2)呼吸、またSnf1やMsn2/4に依存したグルコース非存在下での適応、(3)呼吸やcAMPの一過的上昇に依存しないグルコース再添加による急速な回復、の3つの反応に分類され、転写と共に統括的に制御されていると考えられる。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】800千円 (直接経費: 800千円)