反芻類家畜における形質転換動物の作出と応用に関する基礎研究
【研究分野】応用動物科学
【研究キーワード】
トランスジェニック動物 / EGFP / PCR / DPnI / マウス胚 / トランスジェニック / 形質転換家畜 / 遺伝子導入 / α-ガラクトース / 制限酵素 / 蛍光蛋白 / 胚 / トランスジーン / シバヤギ / ホメオボックス / c-kit / SCF
【研究成果の概要】
1.シバヤギc-kit cDNAに見い出された特異的アラニン残基の挿入について、各種の動物を解析した結果、ウシ科の中でもヤギ、ヒツジに特異的な挿入であることが判明した。c-kitのリガンドであるSCFcDNAのクローニングを行なった結果、5つのisoformsが単離された。そのうちの二つは、従来報告されている動物種にない、新規のSCFのisoformsであった。2.マウスおよびシバヤギの胎盤形成過程におけるホメオボックス含有遺伝子群の関与について検討した。Degenerate oligonucleotide primeを用いたRT-PCR法による解析の結果、両動物種の胎盤において多数のホメオボックス遺伝子の発現が同定され、Hox a9,d9,Emx2.Msx2,ATBFIが、両動物種で共通して発現していた。また、Hox 09,d9の発現が胎盤形成過程において何らかの役割を果たしていることが示唆された。3.形質転換動物の作出効率を向上させる手段して、Bal 31とDpn IによるDNA消化とPCRとを併用したTg胚の選別を試みた。細胞質にDNAを注入し体外で後期胚に発生させたウシおよびマウス胚の98.6%で特異PCR産物は全く検出されなかった。一方、Tg胚のゲノムDNAを酵素処理した場合には、68.6%の胚でトランスジーンに特異的なPCR産物が検出された。また、70.5%のウシ胚でマーカー遺伝子に特異的なPCR物が検出され、Tg胚の選別に極めて有効であることが認められた。4.EGFPをマーカーとしてTg胚の選別法について検討した。受精卵前核にCMV・β-actin/EGFP遺伝子を顕微注入し生存胚を体外培養した。後期胚について蛍光顕微鏡で観察し、14.8%が胚全体で、22.6%がモザイク様の蛍光が観察された。つぎに、モザイク様に発光した胚と全体に発光した胚とに分類し偽妊娠ICRマウスの子宮へ移植した。前者から76.9%、後者から21.6%のTgマウスが得られた。本手法が、Tg胚の選別に極めて有効であることが認められた。
【研究代表者】