【研究領域課題番号】19H03189 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

振動 / モータータンパク質 / 細胞 / 心臓 / 鞭毛 / ミオシン / ダイニン / 心筋 / １分子 / 運動タンパク質

【研究成果の概要】

軸糸ダイニン分子では，Duty ratio（力を出す割合）が低い可能性がある。これを検証するため、ウニ精子鞭毛の外腕にある21Sダイニンの運動アッセイで割合を求めた。ダイニン密度と滑り速度の関係から力を出す割合は約7%となった。このことから、軸糸およびbundle で長さ当たりの力が小さい原因が低いduty ratio にあることが示された。さらに、duty ratio が低い原因を探るため、21S ダイニンのATPase cycle における微小管へのアフィニティーを調べた結果、ADP、AMPPNP、no nucleotide ではダイニンの微小管へのアフィニティーはATP 存在下と比較して3 ％にまで低下することが明らかになった。21S ダイニンのATPase cycle 中で強結合を観察できなかったことは、ダイニンのduty ratio が低い原因の一つであることを示唆する。
ミオシンの分子特性の違いは，心臓や筋肉における収縮，弛緩を担うミオシンとアクチンの相互作用に大きな影響を与える．研究では，心筋ミオシン，骨格筋ミオシンの分子特性が如何にこれらの臓器の収縮機能に活かされているのか検証した．以前の研究結果から，心筋ミオシン集合体の力発生は骨格筋ミオシン集合体のそれとは大きく異なることを見出した．更にシミュレーションモデルによって，これらの違いは各ミオシン分子が発するリバースストロークの頻度に依存する可能性が示唆された．この結果を検証するため，光ピンセットを用いた1 分子計測技術により，ADP とリン酸溶液中において負荷に対する心筋，骨格筋ミオシン1 分子の構造変化を評価した．その結果，心筋ミオシン分子はパワーストロークとリバースストロークを発することによって，３つの構造状態間を遷移することが判明した

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】分子生物学およびその関連分野

【研究領域課題番号】17K19343 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

超解像度 / 金コロイド / ナノメートル精度 / ミオシン / 細胞 / 超解像 / モータータンパク質 / 金ナノ粒子 / 蛍光 / 金微粒子 / １分子計測

【研究成果の概要】

通常の顕微鏡で撮影した画像に対して超解像度を得る方法の開発を行った。骨格筋ミオシンフィラメントに顕微鏡の分解能以内に位置するミオシン２～３分子に金ナノ粒子（40nm）を結合し、高速カメラで金ナノ粒子をイメージングを行った。分解能以内にある複数の金粒子の位置を解析するために、Multi-Emitters Localization 法を用いて、各ミオシン分子の変位に分離することに成功し、アクチンと相互作用時の各分子の動態を0.1msの高時間分解能で計測することがきた。各分子はアクチンとの相互作用時において、10nm程度変位することが明らかとなった。また分子間の動きが同調している様子も観察された。

【研究の社会的意義】

従来の光の分解能を超える超解像顕微鏡が何種類も販売されている。しかし、従来の超解像法の共通した問題点は、画像取得速度が遅いことである。本研究では、この問題点を克服するために高速で超解像を得る顕微鏡の解析法を開発した。この方法によって通常の顕微鏡で細胞の画像を撮影した後に、超解像イメージング画像に変化できる。したがって、通常の顕微鏡の時間分解能で超解像を得ることができる。生物分野全般だけでなく、顕微鏡（や望遠鏡）を使う多くの分野が本研究課題の成果を利用することができるため、応用分野も広がっていくと期待される。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2017-06-30 - 2020-03-31

【配分額】6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】16H04773 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分子モーター / 1分子 / 少数分子 / キネシン / ミオシン / ステップ / 理論 / 細胞 / ダイニン / 運動 / 1分子計測 / モータータンパク質 / メカニズム / 生物物理

【研究成果の概要】

細胞内の物質輸送や細胞分裂を担うモータータンパク質であるキネシン、ミオシンV、ダイニンは一定の歩幅で長距離を解離することなく、前進運動や後退運動を行う。これら三種類のモータータンパク質の１分子の運動特性を統一的に記述するために運動を単純化して、2つの状態を遷移する数理モデルを提案し、このモデルによって本研究や過去の実験結果をうまく説明することができた。
また、筋肉由来のミオシン多分子による力発生を測定した結果、協同的に力発生を行うことが、実験的にもシミュレーションによっても明らかとなった。このような協同的な運動が単離幼若心筋の周期的収縮と関連していることが示唆された。

【研究の社会的意義】

これまでの生命科学は、多様性や複雑性に関する研究が多い一方で、物理学が得意とするような統一性や普遍性の研究が少なく、これらの分野の今後の発展が望まれている。その意味で、今回の運動を簡単な数式で統一的に説明した研究は、輸送タンパク質にとどまらず、ATPを利用する多くのタンパク質の運動を説明できる可能性を秘めており、学術的意義が大きい。また、心筋細胞の振動現象のメカニズム解明は、心臓の運動を記述する際重要である。従って、今後心臓や心臓疾患を理解するための基礎となり、学術的にも社会的にも意義がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】23770119 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

X線結晶構造解析 / 分子認識 / 積荷輸送 / ミオシン / 微小管 / 細胞内輸送 / 積荷認識 / 軸索ガイダンス / モータータンパク質 / 結晶構造解析 / 分子複合体 / 積み荷認識

【研究成果の概要】

モータータンパク質ミオシンによる積み荷輸送は，タンパク質やオルガネラを適切な場所へ運び，細胞での配置を規定するために不可欠なプロセスである．本研究では重要なミオシンの１つmyosin-Xについて、積荷輸送に関与する領域の構造を、積荷分子の１つである軸索ガイダンスに関与するDCCとの複合体として決定することに成功した。また、別な積荷分子インテグリンや微小管との相互作用解析の結果、myosin-Xは積荷分子ごとに異なる認識機構を持つことによって、多様な分子と特異的に相互作用することを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】19770161 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞骨格 / 運動 / モータータンパク質 / ミオシン / メンブレントラフィック

【研究成果の概要】

本研究では動・植物細胞における膜輸送の駆動力であるミオシンの分子機能を、分子生物学およびライブイメージングの手法を用い解析した。
動物において、分子内折りたたみ構造形成能を阻害した変異ミオシンVbをHeLa細胞で発現させることによって、膜交通制御における折りたたみ構造の役割を明らかにした。
植物において、全植物ミオシンのクローニングと発現に成功した。ミオシンメンバー間での広範な機能分担が明らかとなり、植物独自のユニークな輸送制御システムを示した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,670千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 270千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】09480172 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ミオシン / 平滑筋 / モーター蛋白質 / NMR / 核磁気共鳴 / モータータンパク質

【研究成果の概要】

ミオシンはアクチンとともに筋肉の収縮装置を構成し、そのATPase活性は筋肉においてAPの化学的エネルギーを力学的エネルギーへ変換する過程において主要な役割を果たしている。本研究では、分子問相互作用及び分子のミクロ環境の良いプローブである核磁気共鳴(NMR)、ならびに精密3次元構造解析が可能であるX線結晶構造解析を用いて、平滑筋ミオシンおよびキネシン、ncdについて、それらの3次元構造とATPase反応中間体の高次構造について明らかにし、ミオシンにおける化学エネルギーから力学エネルギーへの変換の機序を原子レベルで詳細に明らかにすることを目的として研究を行った。
ミオシン頭部S1とADPとの複合体の^<31>PNMRスペクトル、ならびにそれらの温度およびpH依存性から、平滑筋ミオシンS1についても骨格筋ミオシンS1と同様に、S1・ADP複合体の^<31>PNMRスペクトルが観測できることが明らかとなった。測定の結果、平滑筋ミオシン頭部とADPとの相互作用は、骨格筋ミオシン頭部とADPに比べて相互作用が強く、ADPの^<31>PNMRシグナルのブロードニングが激しいと考えられた。また、ncdおよびキネシンのモータードメインとADPとの複合体の^<31>PNMRスペクトル、ならびにそれらの温度およびpH依存性を観測した結果、骨格筋および平滑筋S1と同じように低温で2種類のコンフォメーションが存在することが明らかとなった。また、ncdについては、ncd・ADP複合体はS1・ADP複合体とは異なり、ADPのα位のリンに由来するシグナルが遊離のものと区別して観測されることが示された。
さらに、昆虫細胞を使って平滑筋ミオシン頭部モータードメインの発現系を構築し、野生型とATPase反応中間体を捕捉すると考えられる変異体の調製に成功した。また、ncdのATPase活性に影響を及ぼすネック領域の効果についても明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】13,100千円 (直接経費: 13,100千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】08458204 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

モータータンパク質 / 微小管 / キネシン / ncd / モータードメイン / 頚部 / 運動極性 / 頸部 / ミオシン / 回転自由度

【研究成果の概要】

キネシンスーパーファミリーに属するncdは、キネシンとは逆に微小管の一端に向かって運動する。両者の頭部の構造は、結晶構造解析により解かれているが、あまり大きく違わないので、運動方向を決定する要因として、頚部が関与するものと考えられる。そこで、キネシン頭部にncdの頚部をつないだキメラタンパク質を作製し、その運動性を調べたところ、ATP非存在下では微小管を結合するが、ATP存在したで微小管から解離してしまい、一方向への運動を観察することはできなかった。ATPase活性を測定すると、KcatおよびK50%MTsの値は、それぞれ7.8S^<-1>および0.22μMであった。同じ長さの頚部を持つキネシンフラグメント(キネシン頭部+キネシン頚部)のそれらの値と比較すると、キネシンのような連続的な運動ができないと考えられる。以上より、ncd頚部は一端への方向性を決定することはできないが、キネシン頭部の持つ+端方向への運動性をキャンセルできることがわかり、頚部が運動方向決定に重要な役割を持つことが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】7,200千円 (直接経費: 7,200千円)