Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

卵成熟誘起ホルモン / 1-methyladenine / 1-メチルアデニン / 受容体 / GPCR / ケミカルジェネティクス / シグナル伝達 / イトマキヒトデ / 卵成熟

ヒトデ卵成熟誘起ホルモンの受容体の同定が本研究の目的であり、昨年に引き続き、申請者がこれまでに見いだした有力候補であるGタンパク質共役型受容体(GPCR)が真の受容体であるかどうかを確かめるための解析を行った。細胞内の候補GPCRの機能阻害を期待して、昨年度に引き続き抗体による阻害を試すとともに、新たに機能不全型GPCR変異体を作成して競合的阻害実験を試した。
抗体による阻害については、細胞内突出部分を抗原とした抗体を細胞内に直接注射しただけでは阻害効果を得られなかったため、本年度は、抗体をGPCRが局在する細胞膜部分へ運搬・濃縮するための機能タンパク質のmRNAをあらかじめ細胞に注射することで、わずかであるがコントロール抗体に比べて卵成熟を阻害する結果が得られた。明確な差が出なかったため、膜へ運搬・濃縮する作用を蛍光標識抗体と混合して検証したところ膜への集積は見られたものの多くは細胞質にとどまっていた。引き続き他の膜局在化シグナルも試している。阻害用の抗体については、他に４種類のペプチド抗体を作成しており、そのうち１種類は全く効果がなかったが、他の３種類については、細胞膜の外側の領域を抗原としているため、培養液に添加して阻害実験を実施するために必要な精製濃縮抗体の準備を進めた。予備実験では効果が見られなかったため、より抗体が反応しやすくなるようにFab断片化抗体の調製を進めている。
抗体以外の阻害実験として、GPCRの機能に重要な働きを担うC末テール部分の一部を欠損させた変異体をいくつか作成した。そのうちのひとつは、変異を入れていないGPCRを発現させた時と比べて、卵成熟誘起ホルモンへの応答性にわずかではあるが差が見られた。発現させたGPCRが正しく膜に局在化したかを確認するため、N末細胞外領域に挿入したTag抗体を用いて関節免疫蛍光染色を行い膜局在化を確認した。

細胞周期 / シダナル伝達 / 卵減数分裂周期 / 卵成熟誘起ホルモン / 受精 / 前核 / ゲノム継承 / シグナル伝達 / DNA複製装置 / 発生・分化 / 核構築 / 卵成熟

世代交代に際してゲノム継承を実現していく分子機構を解明するために、卵細胞における細胞周期制御に至るシグナル伝達と核構築制御を解析した。
1.[卵減数分裂の再開始]ヒトデ卵成熟誘起ホルモン(1-MeAde)の卵表受容体の単離同定をめざした。1-MeAde誘導体を結合させたアフィニティー・フェライトビーズに特異的に結合するタンパク質を、卵膜の可溶化画分から3種(p42、p92、p97)得た。これらは、抗体等を用いた解析から、受容体を構成している可能性が高い。
ヒトデ卵減数分裂周期について、Auroraを解析した。ヒトデAuroraはCdc2の下流で活性化し、一タイプしか存在しないが、脊椎動物で見られる複数タイプの機能を担うことをHeLa細胞を用いて示した。
2.[卵減数第二分裂中期の停止と解除]アフリカツメガエル卵は、減数第二分裂中期に停止して受精を待つ。この停止では、Mos-MAPK経路の直下にあるp90Rskが、Erp1を直接リン酸化して安定化させるとともにそのAPC/C抑制活性を亢進させ、それによってサイクリンBのタンパク分解を阻止していることが判明した。一方、この停止の解除には、従来報告されていたCaMKIIだけでなく、同時にカルシニュリン(CaN)も一過性に活性化する必要のあることを示した。
3.[核構築]アフリカツメガエル未成熟卵では、importin αに依存した核輸送が抑制されており、これはimportin αがannulate lamellaeにトラップされているためであることが判明した。このimportin αのトラップは卵成熟開始とともに解除され、それと、卵成熟による前核形成能の獲得との関連が考えられる。受精後の雌雄両前核の接近と融合については、ヒトデ卵を用いて、細胞周期の進行は必要でないことを示した。

【研究分担者】
大隅圭太 (大隈圭太)	東京工業大学	大学院・生命理工学研究科	准教授	(Kakenデータベース)
立花和則	東京工業大学	大学院・生命理工学研究科	助教	(Kakenデータベース)
奥村英一	東京工業大学	大学院・生命理工学研究科	助教	(Kakenデータベース)
岩渕万里	東京工業大学	バイオフロンティアセンター	助教	(Kakenデータベース)