Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

ケージド遺伝子 / 温度パルス法 / DNAチップ / PCR法 / 筋芽細胞 / GGP-アクチン / アクチンフィラメント / ストレスセンサー / GFP-アクチン / ケージドDNA / 温度パルス顕微鏡法 / 遺伝子ハンドリング / DNAの熱変性

DNAの固定化と選択的回収法(DNAチップの開発):クロム基盤上へのDNA固定化法と、赤外レーザー照射・温度パルス法による選択的な回収法を確立し、その方法の詳細を論文として公表した。これはDNAチップの一つの形態である。Caged DNA合成の試み:DNA塩基のアミノ基を(4,5-dimethoxy-2-nltrobenzyl bromide(DMNBB)で化学修飾し、DNAの複製機能を一旦失活させ、それを紫外線マイクロフラッシュ法によって再活性化するという方針でCaged DNAの合成を試みた。一時はPCR法によって確認できたと思われたが、再現性に問題があり、DNA塩基のアミノが化学修飾に対して活性が高くないと結論した。さらに、Caged遺伝子を調製したという論文が発表されたので、我々は方針を転換し、新手法の開発に力を入れた。GFP-アクチンの心筋培養細胞内発現:ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12へ、蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを導入すること、そしてその未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。その過程でGFP-アクチンが筋収縮系に組み込まれることを示唆する画像を、共焦点蛍光顕微鏡観察によって得た。アクチンフィラメントのストレスセンサー応用:アクチンフィラメントに加わる張力を蛍光画像化し、アクチンフィラメントをストレスセンサーとして利用するための方法を開発しようと、幾つかの試みをした。特殊なGFP-アクチンを発現させたが、単一フィラメントの特性解析には至らなかった。ケモカインリセプターの1分子画像化:細胞表面でケモカインリセプターを1分子蛍光画像化し、ケモカイシ結合に伴う走化性と、レセプターの集合性や運動性を顕微鏡解析した。リセプターはリガンド結合に関わらず2量(数量)体を形成することが明らかになった(論文準備中)。

レーザー光ピンセット / アクチンフィラメント / ミオシン / スペクトリン / 1分子結合力 / 顕微計測 / 生体分子モーター / 顕微操作 / 温度パルス顕微鏡 / pN,nm顕微解析 / アクトミオシン硬直結合 / 双頭結合,単頭結合

(1)アクチンフィラメントの後端に結合した直径1μmのポリスチレンビーズを、レーザー光ピンセットによって顕微操作し、アクチンフィラメントとアクチン結合性タンパク質との間の分子間結合に負荷を加え、結合の破断力などを繰り返し顕微計測することができる方法を、この数年間で我々は確立した。この方法を、アクチンフィラメントとスペクトリン(赤血球の裏打ちタンパク質の一種)との1分子結合(破断)力の計測に応用した。その結果、予備的実験ではあるが、結合の破断力として、平均3pNという値が得られた。これは、アクチンフィラメントとミオシン間の硬直結合力(平均9pN)や、α-アクチニンとの結合力(平均15pN)と比べて有意に小さい。
(2)アクチンフィラメントとミオシン(HMM)分子間の硬直結合の破断力の測定については、単頭のHMMを調製して双頭のHMMと比較した。その結果、単頭HMMの破断力の分布は約7pNにピークを持つのに対して、双頭HMMでは数pNから20pNにわたる広い分布を示した。(7pNと10数pNとに2つのピークをもつ)。このことから、アクチンとHMM分子との結合力は、単頭と双頭とで約2倍異なることが示唆された。
(3)アクチン分子を、蛋白分解酵素Subtilisinで処理すると、アクチンSubdomain2が2カ所で限定分解される(質量分析とペプチドシークエンサーによって切断箇所を同定した)が、そのことによって、HMM分子による滑り速度と滑り力が約20%に減少した。ところが、硬直結合の破断力は70%程度にしか低下しなかった。このことから、アクチンのsubdomain2は、ATP存在下での滑り機能に重要な役割を演じているが、ATP非存在下での硬直結合にはそれほど関与していないことが推論された。

【研究分担者】
藤田英明	日本学術振興会	特別研究員	(Kakenデータベース)
岡野和宣	株式会社日立製作所	中央研究所	主任研究員
安田賢二	東京大学	大学院・総合文化研究科	助教授	(Kakenデータベース)