Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

レーザー光ピンセット / アクチンフィラメント / ミオシン / スペクトリン / 1分子結合力 / 顕微計測 / 生体分子モーター / 顕微操作 / 温度パルス顕微鏡 / pN,nm顕微解析 / アクトミオシン硬直結合 / 双頭結合,単頭結合

(1)アクチンフィラメントの後端に結合した直径1μmのポリスチレンビーズを、レーザー光ピンセットによって顕微操作し、アクチンフィラメントとアクチン結合性タンパク質との間の分子間結合に負荷を加え、結合の破断力などを繰り返し顕微計測することができる方法を、この数年間で我々は確立した。この方法を、アクチンフィラメントとスペクトリン(赤血球の裏打ちタンパク質の一種)との1分子結合(破断)力の計測に応用した。その結果、予備的実験ではあるが、結合の破断力として、平均3pNという値が得られた。これは、アクチンフィラメントとミオシン間の硬直結合力(平均9pN)や、α-アクチニンとの結合力(平均15pN)と比べて有意に小さい。
(2)アクチンフィラメントとミオシン(HMM)分子間の硬直結合の破断力の測定については、単頭のHMMを調製して双頭のHMMと比較した。その結果、単頭HMMの破断力の分布は約7pNにピークを持つのに対して、双頭HMMでは数pNから20pNにわたる広い分布を示した。(7pNと10数pNとに2つのピークをもつ)。このことから、アクチンとHMM分子との結合力は、単頭と双頭とで約2倍異なることが示唆された。
(3)アクチン分子を、蛋白分解酵素Subtilisinで処理すると、アクチンSubdomain2が2カ所で限定分解される(質量分析とペプチドシークエンサーによって切断箇所を同定した)が、そのことによって、HMM分子による滑り速度と滑り力が約20%に減少した。ところが、硬直結合の破断力は70%程度にしか低下しなかった。このことから、アクチンのsubdomain2は、ATP存在下での滑り機能に重要な役割を演じているが、ATP非存在下での硬直結合にはそれほど関与していないことが推論された。

筋収縮 / メカノケミカルカップリング / 筋原線維 / In vitro滑り運動系 / 顕微画像解析 / レーザー光ピンセット / アクチンフィラメント / 分子モーター / in vitro 滑り運動系 / in vitro滑り運動系 / アクチン / ミオシン

1.単一筋原線維の構造・力学特性と化学反応とを光学顕微鏡下で位相差像あるいは蛍光像として同時画像化し、解析することのできる顕微操作・顕微解析装置を製作した。この装置は、2波長蛍光励起装置、倒立顕微鏡、顕微鏡操作装置、蛍光用特殊フィルター・ミラー、double-View (W)光学系、超高感度テレビカメラ、ビデオ、画像処理コンピュータからなる。
2.アクチンフィラメントに特異的に結合し、しかもpH感受性を持つ蛍光物質SNAFL-Phalloidin (SF-Ph)を合成し、これを用いて筋原線維を染色し、ATPase活性に伴うpHの減少を画像として捉えた。しかしSF-Phは2波長励起・1波長検出に適しており、W光学系を活用できないので時間分解能は高々1s程度であった。そこで、1波長励起・2波長検出に適し真の意味で同時画像化が可能なW光学系を活用できるSNARF-Ph (SR-Ph)を特注したので、現在研究を進めている。
3.直径1μm程度のプラスチックビーズを70pNの力で捕捉し、顕微操作することのできるレーザー光ピンセット装置(赤外YLFレーザー(1W)、赤外光導入用に特注改造した倒立顕微鏡からなる)を組み上げた。
4.in vitro滑り運動系において、低濃度のATP存在下でアクチンフィラメントに発生する滑り力と1個のATP分子の分解に伴うステップサイズとを光ピンセットを用いて顕微計測した。滑り力は最大捕捉力の下で約3pNであり、ステップサイズは約10nmであった。一方、ATP非存在(硬直条件)下でのアクチンフィラメントと一個のミオシン(HMM)分子との間の硬直結合の破断力を計測し、平均9.2pNという値をえた。同時に得られた張力-歪み曲線の最大傾斜から求めたHMM分子の弾性率は、約0.5pN/nmであった。