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蛋白質結晶学 / 極低温結晶構造解析 / 分子動力学計算 / 蛋白質水和構造 / ドメイン運動 / ガラス転移 / バイオイオンフォマティクス / バイオインフォマティクス / 蛋白質 / 水和構造 / 低温結晶解析 / 蛋白質水和 / X線結晶構造解析

精緻な分子機械である蛋白質の動作原理や構造構築原理を解明し、その巧みさを学び取ろうと、膨大な数の立体構造解析が行われている。一方で、蛋白質がなぜ水の中で立体構造形成するのか、水は蛋白質ダイナミクスにどのような影響を及ぼすのかといった点については十分明らかにされてきたわけではない。本研究では、蛋白質と水の相互作用をより深く知ることで、蛋白質の立体構造形成、ダイナミクスや機能発現における水の役割をミクロスコピックに解明するための研究の展開を試みた。研究代表者は、これまでに極低温高分解能X線結晶構造解析の方法論を確立すると共に、同解析が蛋白質の水和構造について重要な知見をもたらすことを明らかにしてきた。本研究では、極低温高分解能結晶構造解析、分子動力学計算を実施するとともにプロテインデータバンクに登録された立体構造モデルを利用して、以下の項目について研究を実施し、論文発表を行うと共に、各種国内・国際会議から多数の招待講演を受けた。
(1)蛋白質水和構造の特徴づけ。
(2)水和構造の動的性質と蛋白質ダイナミクスの相関。
(3)極低温解析と分子動力学計算で得られる水和構造の比較。
(4)水和構造の解析、データベース化、水和構造予測計算プログラムの構築。
(5)蛋白質のガラス性転移と水和構造の相関解析
(6)低温結晶構造解析用装置類の開発と構造解析への応用。

微小結晶 / 蛋白質 / X線結晶構造解析 / イメージングプレート / シンクロトロン放射光 / 異常分散法 / 免疫グロブリン / 抗体 / X線結晶構造解析法 / 蛋白質結晶学 / 回折強度測定法 / イメ-ジングプレ-ト / 多波長異常分散法

微小蛋白質結晶のX線構造解析法の開発を目的とし、輝尽性蛍光体イメージングプレートを採用した高感度で高精度のX線カメラ露光リアルタイム検出装置を試作し、X線異常分散効果を利用して構造解析の処理を行うための計算機プログラムシステムを開発した。これらを用い、シンクロトロン放射光による異常分散効果を最適化した回折データを微小蛋白質結晶について測定し、抗体など3種の蛋白質の結晶構造を解析した。
ダンシルリジンに結合するマウス抗体のFvフラグメントについて、多波長異常分散法用の回折データ処理と異常分散項の算出処理のプログラムを用いて解析を進めた。その結果、異常分散パターソン合成による相補性決定部位のメチオニンに結合した白金のサイトを得ることができた。その後、分子置換法とモデル精密化法を併用してこのFvフラグメントの結晶構造を1.6A分解能という抗体では最も高い精度で解析を完了することができた。白色X線による異常分散効果の測定系と処理系も新たに開発し、ラウエ回折法に基づく今後の時分割実験による動的構造研究でも適用可能となった。
マウス抗ニトロフェノール(NP)抗体3B44のFavフラグメンの微小結晶について、開発した検出装置を用いることにより3A分解能の回折データを得ることができた。このものの臭素化NPとの複合体の多波長データでは臭素化NPの結合が十分でなかったため分子置換法を適用し、3A分解能で構造解析に成功した。また、抗体NIG9のFabでも結晶が微小で従来法では回折データが得られなかったが、開発した測定処理系によって2.5A分解能の良好なデータを得た。さらに、リボヌクレアーゼU_2も1.8A分解能での解析を完了した。このものの異常分散差フーリエ合成ではイオウ原子のみを明瞭に電子密度として見いだすことができた。

蛋白質結晶学 / 多波長異常分散法 / X線結晶構造解析 / X線回折強度測定法 / 免疫グロブリン / Fvフラグメント / シンクロトロン放射光 / 異常分散効果 / アミラ-セ阻害剤 / ダンシルリジン

波長可変で高強度のシンクロトロン放射光X線を活用する多波長異常分散法による蛋白質の直接かつ迅速な結晶構造解析システムの確立を目的とした本研究では、まず、高エネルギ-物理学研究所放射光実験施設の波長可変のX線分光装置と水平型四軸X線回折装置からなる測定系を改良した。研究で開発した検出器のデッドタイムの補正法や光学系のアライメント法を組み込んだこの測定系は、四軸回折計法と振動結晶写真法のいずれによる測定でも、任意の波長で極めて高い精度のX線回折強度デ-タを与え、公開共同利用に供されている。また、特性X線源の四軸ゴニオメ-タ測定装置に可搬式の結晶送風冷却装置を組み込んだ精密な強度デ-タ測定系を構築した。一方、多波長の波長可変デ-タを処理して位相決点を行う方法と計算機プログラムを開発し、構造精密化と位相拡大のプログラムと三次元コンピュ-タグラフィクスのプログラムを組み込み、多波長異常分散法の解析プログラムシステムを確立した。
本研究では、マウス抗ダンシルリジン免疫グロブリンIgG2aのFvフラグメントのネ-ティブ構造を決定し、抗原結合部位等の構造知見を得た。このダンシルリジンとの複合体結晶についても1.5Å分解能までの強度デ-タを得て解析を進めている。鉄と銅を導入したアミラ-ゼインヒビタ-結晶などについても異常分散原子の位置を決定して電子密度図を得ることができた。測定系と解析プログラムシステムの開発と評価では、酵素活性を有する鉄錯体の高スピンと低スピンの両状態の結晶構造と、アスパルテ-ム結晶の高水和型と低水和型の双方の結晶構造を解析することができた。本研究で確立し、公開している放射光利用の測定系と解析処理プログラムは、蛋白質をはじめとする広範な結晶構造研究への適用が可能となっている。

【研究分担者】
野口修治	東京大学	薬学部	助手	(Kakenデータベース)
中迫雅由	東京大学	薬学部	助手	(Kakenデータベース)
雨宮慶幸	高エネルギー物理学研究所	放射光実験施設	助教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
中迫雅由	東京大学	薬学部	助手	(Kakenデータベース)