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相同組換え / 二重鎖切断修復 / 遺伝的組換え / Rad51 / Dmc1 / 減数分裂 / RecA / ATPase / タンパク質と酵素 / 核酸 / 遺伝子及び染色体 / 構造生物学 / X線結晶解析 / 生体高分子構造・機能 / 遺伝情報複製・再編 / 染色体構築・機能・分配

相同組換えは、DNAの二重鎖切断損傷の修復や減数分裂期での遺伝的組換えにおいて重要な役割を果たしている。相同組換えの要の反応である相同的対合は、バクテリアRecAおよび2種類の真核生物型RecAホモログであるRad51とDmc1によって触媒されることが知られている。これらの相同的対合タンパク質(RecA、Rad51、およびDmc1)は、WalkerタイプのATPaseモチーフを持ち、単量体としては酷似した立体構造を形成しており、自己会合によりらせんフィラメント状の四次構造を形成する。しかし、Dmc1は、このようならせんフィラメント状構造以外にも8量体のリング構造を形成することが明らかになった。Dmc1とRad51は、互いに50%以上のアミノ酸配列相同性を有するにも関わらず、Dmc1で見られる8量体のリング構造は、Rad51では観察されていない。このようなRad51とDmc1との問の四次構造における差異が、それらの相同組換えにおける役割の違いを生じていると考えられる。申請者らは、X線結晶構造解析法によって、すでにヒトDmc1の8量体リング構造を原子分解能で決定することに成功している。そこで本年度は、このDmc1のリング構造形成の分子機構1を明らかにするために、ヒト由来のRad51とDmc1とのキメラタンパク質のデザインを行った。それらのRad51/Dmc1キメラタンパク質を用いて物理化学的および生化学的解析を行い、Rad51およびDmc1のリング-フィラメント構造の変換機構の解析を行う予定である。また、Rad51およびDmc1の性質に変化を生じる変異体の作製に成功した。これらの点変異体Rad51およびDmc1の物理化学的および生化学的解析の結果、Rad51のDNA結合部位やDmc1のリング構造形成に重要なアミノ酸残基の特定に成功した。

遺伝情報再編 / 生体高分子構造・機能 / 遺伝子及び染色体 / タンパク質と酵素 / 核酸 / 構造生物学 / X線結晶解析 / 染色体構築・機能・分配

ゲノムDNAは細胞内において常に損傷を受けている。中でも二重鎖切断損傷は、染色体異常の直接的な原因となる。二重鎖切断は、相同組換えを経由したDNA修復経路によって速やかに修復されるが、そのメカニズムについては生化学的にも構造生物学的にも解析が進んでおらず、その分子機構の理解は不十分である。相同組換え反応の要の反応は相同的対合反応である。相同的対合反応の分子機構を明らかにするために、減数分裂期での相同対合反応の中心酵素であるヒトDmc1の立体構造解析をX線結晶回折法によって行い、Dmc1が8量体のリング構造を基本とする16量体のダブルリング構造を形成することを明らかにした。そして立体構造に立脚した変異体解析によって、Dmc1の16量体ダブルリングにおけるDNA結合部位を同定した。Dmc1ダブルリングの中央の穴は約30オングストロームの直径をもち、その中央の穴に糸を通すように二重鎖DNAを結合することが分かった。単鎖DNAは、ダブルリング構造の側面に存在する単鎖DNA専用の溝に結合することを変異体解析によって明らかにした。また、出芽酵母の遺伝学的解析より、Dmc1と機能的な相互作用が示唆されているTBPIP/Hop2に着目し、リコンビナントタンパク質として大量に精製する系を確立した。そして精製されたTBPIP/Hop2が、Dmc1によって触媒される相同的対合反応を著しく活性化することを見いだした。TBPIP/Hop2のドメイン解析を、欠失変異体作製法によって行った結果、TBPIP/Hop2はN末端領域にてDNAに結合するが、C末端領域はDmc1依存的な相同的対合反応の活性化に重要であることを明らかにした。