Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

本年度、分子遺伝学手法の特性などを考慮し計４年間で実施する研究の第二年度として、計画【1】の分子遺伝学的解析のパイロット実験から更に進んだ候補因子の同定に成功した。また、計画【2】の実践投入の予備的実験を踏まえた実験計画を継続して行なった。
【１】翻訳終結状態を識別する分子機構の分子遺伝学解析。
分子遺伝学的手法（forward/reverse genetics法）で、tRNA擬態蛋白質が関わる翻訳終結機構・蛋白質合成品質管理機構をモニターするアッセイ株の構築を行い、関連する新規因子およびその機能部位探索を実施した。得られた因子の既知因子（ASC1, S20等）については、Hel2相互作用ドメインの解明とその機能モデルを構築することができた（現在論文投稿中）。一方、新規な因子も同定され、その変異体がクラスターする領域を同定しつつある。
【２】 mRNA上の翻訳終結のための因子群の動態を可視化する新規手法開発
本研究計画では、正常・異常翻訳終結にかかわる因子群にRNA編集酵素を融合した因子を細胞内に導入することで、mRNA遺伝暗号読み枠上のどのような領域（配列コンテキストや、5’CAP-mRNA-polyA tail構造上の相対位置）でリボソームにアクセスするかを細胞全体のトランスクリプトーム上にマップすることができる。本年度は、昨年度につづき、目的タンパク質を用いたmRNA-seq解析に必要な遺伝子コンストラクト、発現系の構築を引続き進め、NGSによる解析のためのサンプル調整を試行錯誤した。