定量的生体分子イメージング・操作法の開発
【研究分野】分析化学
【研究キーワード】
生体分析 / イメージング / 蛍光 / リン酸化 / GPCR
【研究成果の概要】
課題1:生細胞内ではたらく小数分子の可視化・定量法では,細胞内在性のテロメアRNAを1分子レベルで可視化し,その数を計測する新たな技術を開発した.RNA結合タンパク質の一つPumilio (PUM1)にアミノ酸変異を加え,UUAGGGUUを特異的に認識するように分子設計した.生細胞内にプローブを発現させ,全反射蛍光顕微鏡で細胞核内のテロメアRNAを1分子レベルで観測することに成功した.
課題2:光によるリン酸化酵素活性の制御法では,細胞内キナーゼ(Akt)活性光操作法を開発した.CRY2にはAktを,CIB1のN末側ドメイン(CIBN)には膜局在化シグナル(Myr)を連結した.光照射すると, CRY2に融合したAktは細胞膜に局在し,Aktの基質タンパク質をリン酸化することを実証した.光強度,照射時間を変え,膜への移行速度,および膜からの解離速度を定量的に解析した.ウエスタンブロッティング法および逆転写PCRによって,光依存的に細胞膜に移行したCRY2-Aktの活性化を評価した.基質タンパク質の1つであるNO合成酵素(eNOS)が光照射回数依存的にリン酸化されること,またAktの下流で制御されているAtrogin遺伝子発現が抑制されることを実証した.
課題3:Gタンパク質共役受容体(GPCR)活性の評価法と制御分子の探索では,分割ルシフェラーゼの再構成法”を展開し,GPCRーβarrestin相互作用の高感度検出システムを開発した.重症薬疹の原因リセプターをターゲットとし,化合物ライブラリースクリーニング用細胞の樹立に成功した.
【研究代表者】
【研究分担者】 |
芳賀 早苗 | 北海道大学 | その他の研究科 | 研究員 | (Kakenデータベース) |
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【研究種目】基盤研究(A)
【研究期間】2014-04-01 - 2015-03-31
【配分額】15,340千円 (直接経費: 11,800千円、間接経費: 3,540千円)