Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

RNA / 生物発光 / 顕微鏡 / 多細胞 / バイオイメージング / 1細胞解析 / 遺伝子発現

本研究の目的は、組織・オルガノイド・小動物個体など多数細胞の集合により機能発現している生体試料について、その試料を生かしたまま遺伝子発現の時空間解析を行うイメージング技術群を創出することにある。すなわち「細胞集団内において、個々の細胞における遺伝子発現のどのような時空間的特徴が、標的とする生理現象の発現における核となる細胞の生成や、その後の増殖・伝播に対する必要条件となるか？」という「問い」を設定した。本研究ではこの「問い」に対する答えを得るために必要な、「生きた多細胞試料における遺伝子発現時空間情報の1細胞解像度経時追跡法」という、これまでに全く存在しない技術を創出することを目的としている。
この目的を実現するために、本研究では①遺伝子発現産物すなわち内在性RNA可視化定量を実現する生物発光プローブの開発②生体試料長期培養機能を備えた1細胞解像度4D生物発光顕微鏡の構築
を行っている。
①の生物発光プローブの開発では、申請者が開発したRNA検出の独自技術であるmPUMテクノロジーを利用して、試験管内および生細胞内において標的RNAを生物発光で検出するプローブの構築を行った。②の顕微鏡開発においては、細胞培養環境を顕微鏡上に構築し、さらに薬液添加なども行いながらハイスループットに観察を行うシステムの構築を行った。さらにレンズアレイやホログラフィーを用いた３次元観察法の構築にも取り組んでおり、4D生物発光顕微鏡の構築に向けて進んでいる。

バイオイメージング / 生物発光 / RNA / 細胞 / 遺伝子発現

本研究は生きたままの培養細胞試料を対象に、細胞サイズより高い解像度で特定の遺伝子発現の時空間プロファイルを可視化追跡する手法の開発を目指している。この目的のために、20１９年度までにRNA定量発光プローブの設計と開発を行った。2020年度には生きた培養細胞内における本プローブの性能評価を行った。
本プローブは変異RNA結合タンパク質ドメインmPUMと発光タンパク質NLucの二分割体からなる。標的RNA存在下において、本プローブのmPUM領域が標的RNAに結合することで、NLuc二分割断片が互いに近接し再構成反応が生じ発光を示す。二分割蛍光タンパク質再構成反応と異なりNLucの再構成反応は可逆的であることから、本プローブはRNA量の増減に応答した発光の増減が期待できる。
標的RNAとしてマウス由来β-actin mRNAを選び、作成したプローブの遺伝子をヒト由来細胞株HEK293およびマウス由来細胞株NIH3T3に導入した。これら細胞の発光測定を行ったところ、マウス由来細胞であるNIH3T3のみで発光が検出され、標的遺伝子を持たないヒト由来細胞であるHEK293細胞では有意な発光が検出できなかった。また、HEK293細胞にプローブの標的配列と赤色発光タンパク質mCherryの融合遺伝子をプローブ遺伝子とともに導入し発光顕微鏡を用いて１細胞解像度で観察した。その結果、個々の細胞におけるプローブ由来の発光強度とmCherry由来の蛍光強度に相関が見られた。この結果から、生細胞内において本プローブは標的遺伝子の存在量に応じた発光強度を示し、顕微鏡により１細胞解像度で標的遺伝子発現量を評価できることが確かめられた。