Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

バイオイメージング / 生物発光 / RNA / 細胞 / 遺伝子発現

本研究は生きたままの培養細胞試料を対象に、細胞サイズより高い解像度で特定の遺伝子発現の時空間プロファイルを可視化追跡する手法の開発を目指している。この目的のために、20１９年度までにRNA定量発光プローブの設計と開発を行った。2020年度には生きた培養細胞内における本プローブの性能評価を行った。
本プローブは変異RNA結合タンパク質ドメインmPUMと発光タンパク質NLucの二分割体からなる。標的RNA存在下において、本プローブのmPUM領域が標的RNAに結合することで、NLuc二分割断片が互いに近接し再構成反応が生じ発光を示す。二分割蛍光タンパク質再構成反応と異なりNLucの再構成反応は可逆的であることから、本プローブはRNA量の増減に応答した発光の増減が期待できる。
標的RNAとしてマウス由来β-actin mRNAを選び、作成したプローブの遺伝子をヒト由来細胞株HEK293およびマウス由来細胞株NIH3T3に導入した。これら細胞の発光測定を行ったところ、マウス由来細胞であるNIH3T3のみで発光が検出され、標的遺伝子を持たないヒト由来細胞であるHEK293細胞では有意な発光が検出できなかった。また、HEK293細胞にプローブの標的配列と赤色発光タンパク質mCherryの融合遺伝子をプローブ遺伝子とともに導入し発光顕微鏡を用いて１細胞解像度で観察した。その結果、個々の細胞におけるプローブ由来の発光強度とmCherry由来の蛍光強度に相関が見られた。この結果から、生細胞内において本プローブは標的遺伝子の存在量に応じた発光強度を示し、顕微鏡により１細胞解像度で標的遺伝子発現量を評価できることが確かめられた。

活性酸素種 / 生物発光 / 生物発光タンパク質 / 細胞 / イメージング / プローブ / ルシフェラーゼ / 分泌

活性酸素種は，ガンや糖尿病，心血管疾患（心筋梗塞，脳卒中，脳梗塞，動脈硬化）など，すべての疾患のうち約90パーセントにも及ぶ疾患の原因になっていることが知られている．本研究では活性酸素種の細胞内動態を可視化する新しい分子プローブを開発した．本研究での技術開発により，様々な疾患に関係する活性酸素種の動態を簡便かつ正確に計測できるようになったインパクトは非常に大きい．

生体機能関連化学 / 生物発光 / 細胞 / 生体 / イメージング / プローブ / ルシフェラーゼ / ガン細胞 / 転移 / 可視化 / エネルギー移動 / 蛍光

本研究では,海洋生物である橈脚類(ガウシア・プリンセプス)由来のルシフェラーゼを出発物質として,超高輝度の変異体を論理的に開発した.ガウシアルシフェラーゼの酵素活性中心を推定し,部位特異的アミノ酸変異導入を行った.開発した変異体の中には,オリジナルのガウシアルシフェラーゼに比べて,10倍程度高輝度化した変異体や,スペクトルが33nm長波長化した変異体が含まれ,これらはバイオアッセイにおいて非常に有用なツールを提供する.この変異体の有用性は,BALB/cヌードマウスにおいて,当該ルシフェラーゼ変異体を発現するマウスB16メラノーマ細胞の肺への変異を高感度に可視化できたことでも明らかである.