Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

タンパク質 / １分子観察 / 低温 / 分光 / 構造 / 物理化学 / １分子分光 / インフルエンザ / 単一分子分光 / 分子分光 / 一分子計測 / プロトンチャネル / 光学顕微鏡 / 実験

温度1.5 Kに冷却した生体分子の三次元イメージングをするための１分子蛍光顕微鏡を開発した。この顕微鏡の特性をＱdotにより評価した。まず、この顕微鏡は635, 532, 405 nmのどの波長でも色収差なく使用することが可能であった。さらに、その焦点付近の光分布（点像分布関数）は理論値の1.2倍以下であった。これを用いて、２個の分子の位置決定精度（解像度）を見積もったところ、焦平面方向が3 nm、光軸方向が 18 nmであった。

アミノ酸 / 単一分子分光 / 紫外分光 / 分光 / 顕微鏡 / 紫外 / タンパク質

本研究課題の当初の目的は、アミノ酸残基を蛍光プロープとすることで単一タンパク質分光を全てのタンパク質に適応できる分光法とすることにある。この技術はプローブとしての高い応用性に加えて、光センサータンパク質の生理機能を解明につながる学術的にも重要なタンパク質の構造情報を引き出すことができると考えていた。
2年間の研究成果として、世界的に見てユニークな可視波長域(波長400-600nm)の単一分子蛍光分光装置の開発に成功した。この装置のポイントは2つある。1つは、光学顕微鏡の空間操作機構の改良を行うことで、精度良く一分子を観測できるようにした。2つ目は、昨年度実施した対物レンズの球面収差を補正により、背景光を半分に抑えることに成功した。これらの技術革新の結果、ミドリムシの光回避応答に関係するフラビンタンパク質の一分子分光に成功した。この結果から、当初の目標であった単一アミノ酸の動きを分光学的に追跡することに成功した。これは、温度数ケルビンにおけるフラビンタンパク質の1分子分光の世界で初めての成功例である。
上にあげた改善を尽くしても、芳香族アミノ酸自身を直接的に観測するための紫外域の実験(波長200-300nm)は不可能であった。これを実現するためには、対物レンズの性能を上げ、空間分解能を向上させることが必須であると認識している。しかし、これまでは波長800nmが短波長の限界であった温度数ケルビンの単一分子分光を可視波長域に広げたことは学術的に大きな進歩であると考えている。

分光 / 低温 / タンパク質 / 単一分子分光 / 赤外 / 中赤外 / アミドI / 単一分子 / 一分子計測(SMI) / 化学物理 / 光物性 / 物性実験 / 生物体分子 / 一分子計測(SDM) / 生体分子

本研究では、これまで誰も成功していなかったタンパク質の中赤外吸収スペクトルの1分子観測に成功した。これまで、中赤外吸収を測定するには、感度が良いとされる顕微赤外分光装置でも、100万個のタンパク質が必要であり、1分子の観測例は無かった。そこで、我々は従来法を改良するのではなく、以下に示す全く新しい光学課程を用いて、これを1分子観測を実現した。数ケルビンでも、タンパク質を結合させた色素の蛍光測定し続けていると、無蛍光状態になる。この時、タンパク質に共鳴する赤外光を入射すると、色素の状態が無蛍光状態から蛍光状態に変化することを発見した。我々はこの光学現象を用いて、タンパク質の赤外吸収スペクトルの1分子観測に成功した。

単一分子分光 / タンパク質 / 分光 / 蛍光分光 / 単一分子 / 多光子励起 / 紫外

本研究課題は「多光子励起による単一タンパク質分光装置の作製」である。本年度はこの研究に対してすべての光学系に反射光学系を用いた低温の顕微鏡を作製し、研究に取り組んだ。本年度中に論文掲載まで至らなかったものの、本課題を遂行するに必要であった「低温で使える反射型対物レンズの開発」および「多光子励起による単一タンパク質の観測」に成功し、論文を投稿および執筆中である。2年間という短い期間のうちに二報の欧文誌に掲載できるような成果が出たということは、本課題がせいこうであったことを物語っている。さらに、分光装置および対物レンズに関するフルペーパーを執筆予定であり、これを合わせると非常に目立った成果であった。
成果の詳細について以下に述べる。(1)「低温で使える反射型対物レンズの開発」について。これまで我々は低温の単一タンパク質分光を色収差の大きい非球面単レンズを用いていた。このため、色収差が小さい近赤外領域でも100nmくらいが使用可能な波長範囲であった。そこで、我々は合成石英で一体成形の反射型対物レンズを開発・製作し、ヘリウム温度下(1.5K)でも可視全域に渡って色収差無く使用可能なことを示した。(2)「多光子励起による単一タンパク質の観測」について。(1)に述べた対物レンズと多光子励起による優位点を活かして、二光子励起による単一タンパク質分光に成功した。用いたタンパク質の蛍光極大波長は約500nmであり、測定が難しい可視域のタンパク質の蛍光を捕らえることに成功した。