Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

電子線回折 / 結晶解析 / 構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / 低温試料ホルダー / 蛋白質結晶 / データ収集

本研究では、X線結晶解析にかからないような薄い結晶からでも蛋白質の構造決定を行えるよう、電子線回折用回転カメラとその関連技術の開発を目標とした。生物学的に重要な膜蛋白質では特に数層しかない結晶が得られることも多いからである。この目的のために、(i)既存の電子顕微鏡の大幅な改造、(ii)コンピューター制御ソフトウェアの開発、(iii)高傾斜角低温試料ホルダーの開発を行った。また、同時に、電子線回折パターンの指数付、反射点の積分強度の計算回折強度のスケーリングのためのソフトウェアの開発も行った。このような開発は、数層から成る結晶の場合、X線回折にはかからないことと、回折パターンは三次元結晶からのものとして扱わなければならないが既存のX線結晶解析用ソフトウェアでは処理できないためである。
回転カメラの最初のものは、DCモーターと内蔵ロータリーエンコーダー、スロースキャンCCD検出器を用いて実現された。これは、大幅な改造を必要とするわけではないので、現代の電子顕微鏡の大部分のものに設置可能である。このシステムの性能を検定するため、カルシウムATPaseの超薄結晶に適用し、傾斜角±30°までのデータを収集した。本研究で開発した「最低電子線量電子線回折法」を用いることにより、100枚もの回折パターン(回転写真)を同じ結晶から得ることが出来るようになった。さらに精度を上げるために、第2のものを作製した。これはハイデンハイン社の高精度ロータリーエンコーダーとパルスモーターを用いたものである。ハードウェアは完成したが、制御ソフトウェアは未完成の部分を残している。しかしながら、これまでに得られた予備的結果は大変期待が持てるものである。

電子顕微鏡 / 蛋白質結晶 / 電子線回折 / 氷包埋法 / 構造解析 / 電子線損傷 / クライオトランスファー / 結晶解析 / 電子線回析 / 低電子線量法 / CCDカメラ / 電子線 / 三次元構造解析

本年度は、昨年度の結果をふまえて、電子顕微鏡の仕様を決定し、数多い改造を含め、実際に電子顕微鏡の製作を行った。実験としては、低電子線量法の改良と、クライオトランスファーの最適化のための真空系の見直しに特に重点を置いた。
実際の蛋白質結晶の観察にあたっては、氷包埋試料を用いるため、電子線損傷の最小化と、試料の汚染を防止することが極めて重要になる。低電子線量法では、電子線回折との有機的結合をはかるとともに、傾斜試料のために多点でフォーカスを合わせられるようにした。また、これまで目的とする領域に不必要な電子線が照射されるのを防ぐためには、ビームを振ることによって逃げていたが、電子銃のバイアス電圧や、フィラメント電流を変化させる方法も検討した。その結果、電子銃のバイアス電圧を変える方法が使え、ビームを振る方法よりも優れている可能性があることが判明した。一方、氷包埋試料の観察の最適化のために、クライオトランスファー時の霜の発生を防ぐシールドの開発を行うとともに、試料汚染防止装置の効果の検証、ドラッグポンプを用いた粗引真空系の最適化を図った。実際、配管材料等を見直すことにより、これまでよりも2ケタ良い真空度を得られることがわかった。このことは、フィルムから発生する水蒸気による試料の汚染を防ぐのに大きな効果があるはずである。
数多くの改良によって、蛋白質結晶の構造解析のために最適化された電子顕微鏡をつくりあげることが出来たが、電子線回折パターンの収集は、非常に限られた予算のために満足できる結果が得られたとは言い難い。

【研究分担者】
鈴木清一	代表取締役
小笠原光雄	計測器事業部・科学機器システム本部・第一設計部	技師
中迫雅由	東京大学	分子細胞生物学研究所	講師	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
大林秀仁	計測器事業部・第一設計部	部長