Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

バイオナノゲージ / アクチンフィラメント / 微少管 / 分子モーター / 心筋培養細胞 / GFP-アクチン / タンパク質腺維状重合体 / タンパク質歪みゲージ

タンパク質線維状重合体として、アクチンフィラメントと微小管を取り上げ、これらの機能(ミオシンやキネシンなどの分子モーターの運動性への寄与)を解折するとともに、"生体ナノゲージ"として細胞生物学研究に利用することを企てている。その第一歩として、蛍光色素をラベルしたアクチン分子をアクチンフィラメントに組み込み、フィラメントの状態を蛍光画像化しモニターすることを試みている。1)蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを、ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12に導入し、その未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。まず、アクチン分子のN末端とC末端にそれぞれGFPを導入し培養心筋細胞に発現させたところ、細胞は正常に発達し、GFPアクチンはフィラメントに組み込まれた(共焦点蛍光顕微鏡により観察)。つぎに、アクチン分子を2つの部分に分割し、そこに、前後を入れ替えたGFPを導入した。こうすることによってGFPの構造を不安定化し、アクチン分子に加わる力によって生じる分子歪みに応じてGFPの蛍光性が変化することを期待した。これまで、分割する場所を2箇所検討したが、両方ともに大量発現させると、細胞は正常には発達しないことが分かった。現在、別の部位へのGFPの導入や、変異アクチンの発現量の制御、別タイプのGFP導入アクチンの調製を行っている。2)アクチン分子のCys374を蛍光ラベルし、これをフィラメントに導入することによってフィラメントの状態をモニターすることを試みた。ローダミンを導入するとミオシン分子モーターの運動性(運動速度、ATPase活性)が導入率に応じて減少することを見出した。今後は、フィラメントに負荷を加えることによる蛍光強度や蛍光スペクトルの変化、モーター機能への影響を、1本のフィラメントのレベルで検討したい。

DNAチップ / ケージドDNA / ケージド遺伝子 / PCR法 / 心筋細胞培養系 / GFP-アクチン / アクチンフィラメント / ストレスセンサー

Caged遺伝子の合成:Caged mRNAを作成するために、Caged DNAの調製を試みてきた。Cagedのための一つの方策として、DNA塩基のアミノ基をDMNBB(4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl bromide)で化学修飾し、DNAの複製機能を一旦失活させ、それを紫外線照射によって再活性化する、という方針で不活性化DNAの合成を試みた。一時はPCR法によって確認できたと思われたが、再現性に問題があり、結局DNA塩基のアミノが化学修飾に対して活性が高くない、という結論に達した。この間、Caged遺伝子を調製したという報告が数編発表される状況になったので、我々は方針を転換し、目的の研究課題の鍵となる、新しいタイプのDNAチップや細胞操作開発、それに、細胞機能解析のための新手法の開発に力を入れることとした。遺伝子の固定化と選択的回収技術:昨年度までの研究を進め、Cr基盤上へのDNA固定化法と、赤外レーザー照射による選択的な回収法を確立し、その方法の詳細を論文として公表した。GFP-アクチンの心筋培養細胞内発現:ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12へ、蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを導入すること、そしてその未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。その過程でGFP-アクチンがどのように細胞骨格や筋原線維収縮系に組み込まれていくかを、共焦点蛍光顕微鏡を用いて解析している。アクチンフィラメントをストレスセンサーとして用いることの試み:GFP-アクチンを用いて、アクチンフィラメントに加わる張力を蛍光画像化するための方法を開発しようと、幾つかの試みをした。アクチンフィラメントをストレスセンサーとして用いることが出来れば、その細胞機能解析への応用は計り知れないものがある。

ケージド遺伝子 / 温度パルス法 / DNAチップ / PCR法 / 筋芽細胞 / GGP-アクチン / アクチンフィラメント / ストレスセンサー / GFP-アクチン / ケージドDNA / 温度パルス顕微鏡法 / 遺伝子ハンドリング / DNAの熱変性

DNAの固定化と選択的回収法(DNAチップの開発):クロム基盤上へのDNA固定化法と、赤外レーザー照射・温度パルス法による選択的な回収法を確立し、その方法の詳細を論文として公表した。これはDNAチップの一つの形態である。Caged DNA合成の試み:DNA塩基のアミノ基を(4,5-dimethoxy-2-nltrobenzyl bromide(DMNBB)で化学修飾し、DNAの複製機能を一旦失活させ、それを紫外線マイクロフラッシュ法によって再活性化するという方針でCaged DNAの合成を試みた。一時はPCR法によって確認できたと思われたが、再現性に問題があり、DNA塩基のアミノが化学修飾に対して活性が高くないと結論した。さらに、Caged遺伝子を調製したという論文が発表されたので、我々は方針を転換し、新手法の開発に力を入れた。GFP-アクチンの心筋培養細胞内発現:ニワトリの未分化筋芽細胞・マウス筋芽細胞株C2C12へ、蛍光タンパク質GFPをfusionしたアクチンのプラスミドを導入すること、そしてその未分化細胞を筋管へと分化させることを試みた。その過程でGFP-アクチンが筋収縮系に組み込まれることを示唆する画像を、共焦点蛍光顕微鏡観察によって得た。アクチンフィラメントのストレスセンサー応用:アクチンフィラメントに加わる張力を蛍光画像化し、アクチンフィラメントをストレスセンサーとして利用するための方法を開発しようと、幾つかの試みをした。特殊なGFP-アクチンを発現させたが、単一フィラメントの特性解析には至らなかった。ケモカインリセプターの1分子画像化:細胞表面でケモカインリセプターを1分子蛍光画像化し、ケモカイシ結合に伴う走化性と、レセプターの集合性や運動性を顕微鏡解析した。リセプターはリガンド結合に関わらず2量(数量)体を形成することが明らかになった(論文準備中)。

【研究分担者】
藤田英明	日本学術振興会	特別研究員(PD/">(Kakenデータベース)

【研究分担者】
東條正	早稲田大学	理工学総合研究センター	研究員

【研究分担者】
藤田英明	日本学術振興会	特別研究員	(Kakenデータベース)
岡野和宣	株式会社日立製作所	中央研究所	主任研究員
安田賢二	東京大学	大学院・総合文化研究科	助教授	(Kakenデータベース)